книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

ряющийся в области малых магнитных полей. Вполне возмож­ но, что он обусловлен радикалом серы

н	н	О
1	1	м
1	1	II
N	— с — с —
1	1	— н
	I

Н — с

1

S-

Отсюда следует, что локализация первичных радикалов, об­ разованных при поглощении излучения, продолжает изменяться до тех пор, пока, наконец, большая часть спина не оказывается локализованной на атомах серы или в группах глицина. Сущест­ вует два рода толкований явления внутримолекулярного пере­ носа энергии или перераспределения энергии. Эффективным ме­ ханизмом может служить миграция вдоль полипептидной цепи образовавшихся под влиянием излучения «электронных дырок»

или же, альтернативно, перенос энергии	может быть обуслов­
лен «миграцией» радикального состояния,	появляющегося при

удалении атома водорода или боковой группы аминокислоты. Следует также помнить о том, что при анализе межмолекуляр­ ного переноса спина (см. разд. 6.5) был обнаружен радикал, локализованный на атоме серы (см. рис. 46). Поэтому с энер­ гетической точки зрения сера кажется наиболее выгодным ме­ стом стабилизации радикала.

Величины	выхода	радикалов	G в сухих облученных фермен­
тах лежат в	области	от 1 до 7	(26), т. е. для образования ра­

дикала, который экспериментально можно наблюдать, требуется от 15 до 100 эв. Так как эта энергия того же порядка, что и энергия, необходимая для инактивации, и поскольку зависи­ мость от температуры такого рода явлений часто очень близка (см. рис. 50), вполне вероятно, что большая доля инактивации, вызванной облучением,-—результат образования первичных радикалов.

Учитывая то, что природа глицинподобных радикалов до сих пор до конца не понята, особый интерес приобретает экспери­ мент Риза с сотр. [30].- Они помещали облученную РНК-азу в атмосферу тритированного H2 S. Образованные облучением ра­ дикалы взаимодействовали согласно уравнению

М* + a H2 S-H».M3 H + 3 HS-.

(9.6)

Затем РНК-азу гидролизовали, после чего смесь разделяли на индивидуальные аминокислоты. Вопреки ожиданиям; основная доля радиоактивности оказалась сосредоточенной не в глицине, а (в убывающем количестве) в лизине, метионине, пролнне и гистидине. В небольших концентрациях она была обнаружена в фенилаланине, изолейцине и валине. Согласно этим данным, радикалы после внутримолекулярного переноса спина не локали-

130

зуются преимущественно в глицине, а скорее в ряде других аминокислот, именно в тех, которые с наибольшей степенью ве­

роятности разрушаются во время облучения	(см. табл. 10).
9.4. Изменения в облученных молекулах	фермента
Следующая ступень в изучении действия излучения на фер­
менты — определение структурных и молекулярных			изменений.
В разд. 9.1 было показано, что последовательность			аминокислот
(т. е. первичная структура фермента) весьма		однозначно опре­
деляет его конформацию и, следовательно,	его	ферментативную

активность. Именно поэтому естественно задать вопрос, какая из аминокислот претерпевает изменения в облученной РНК-азе, поскольку изменения в первичной структуре вызывают измене­ ния конформации, что в большинстве случаев ведет к потере ферментативной активности.

Изменения в первичной структуре можно определить анали­ зом ее аминокислотного состава. В верхней части табл. 10 при­ водится список аминокислот, претерпевающих изменения в РНК-азе, облученной в разных условиях. Согласно Аугенштейну [3], содержание цистина в облученных ферментах умень­ шается. После появления этой работы в литературе не раз вы­ сказывалась мысль о том, что разрыв дисульфидных связей может быть причиной потери ферментативной активности. Одна­ ко, как показано ниже, этот механизм не играет существенной роли. Любопытно отметить, что те же самые аминокислоты изме­ няются, когда растворы РНК-азы подвергаются действию ато-. марного водорода или у'-облучению. Из всех этих данных был сделан общий вывод о том, что потеря ферментативной актив­ ности РНК-азы вызывается изменением некоторых особых ами­

нокислот. К этому вопросу мы еще раз вернемся в разд.			9.7.
В настоящее время	имеются данные и об изменениях, проис­
ходящих во вторичной	структуре облученных	ферментов. Облу­
чение, несомненно ведет, к развертыванию		молекул. Об	этом

•свидетельствуют изменения в оптическом спектре поглощения,

оптическом вращении, коэффициенте седиментации,	вязкости и
в числе атомов водорода, способных вступать в	обменные

реакции с дейтерием, а также легкость, с которой облученные ферменты могут перевариваться другими ферментами. В течение ряда лет считалось, что, несмотря на наличие экспоненциальных

кривых доза — эффект, инактивация		фермента	не	является		чи­
стым эффектом «все или ничего». Хаскилл и Хант				[11]	показа­
ли, что после облучения в активных молекулах фермента					присут­
ствуют латентные повреждения,	не	связанные	непосредственно
с активным центром.. Как видно	на	рис. 66, величина			D37	для

инактивации РНК-азы у-квантами в присутствии кислорода рав­ на 22 Мрад, а для образцов, восстановленных и вторично окис­ ленных после облучения, только 12 Мрад. Таким образом, почти

5* 131

половина ферментативной активности облученных молекул те­ ряется при обработке после облучения. Это показывает, что имеются латентные повреждения в части тех молекул РНК-азы, которые сохраняют активность после облучения, и что эти по­ вреждения препятствуют правильному свертыванию молекулы при восстановлении.

51	1 -	1	1	г	I	.	I
О	5	10	15	20 .	25	30	35

Доза, Нрад

Рис. 66. Инактивация сухой РНК-азы у-пзлуче- нием Со 6 0 в атмосфере кислорода.

Активность облученной РНК - а зы измерялась либо непосредственно после облучения (/), либо после вос­ становления с последующим вторичным окислением

(2)[Щ .

9.5.Выделение и идентификация продуктов облучения

Несмотря на то, что описанные выше экспериментальные наблюдения выявили большое число физико-химических и хими­ ческих изменений, вызванных в ферментах ионизирующим излу­ чением, они все же не позволяют составить законченную картину процессов, связанных с инактивацией. Чтобы получить представ­ ление об этих процессах, необходимо исследовать продукты облучения после их отделения от неповрежденных молекул. Эта операция успешно осуществляется с помощью хроматографии с использованием декстранового геля — сефадекса. Разделение на сефадексе — результат диффузии малых молекул в гель, вследствие чего они элюируют из колонки медленнее, чем круп­ ные молекулы.

На рис. 67 показана картина элюции РНК-азы. Необлученный фермент (см. рис. 67, а) дает главный пик (I,,), состоя­ щий из нативиого мономера РНК-азы, и пик меньшего размера

132

( П п ) , отражающий димеры, образующиеся во время очистки фермента. Когда РНК-аза облучается в аэрированном водном

растворе, то	появляются два новых пика ( 1 д и Н д ) .	При	увели^
чении дозы	пик 1н уменьшается, в то время как пик	П д	равно­

мерно увеличивается. Компонент 1д первоначально увеличивается

1А Контроль I

А-

	1,2
4	0,6	"и	\ 1300

300	400	500	300	400
		Объем	зАюата,	мл

Рис. 67. Хроматографическое разделение 90 мг РНК-азы после об- •

лучения в водном'растворе				(5 мг/мл) у-квантами Со6 0 :
• — п о г л о щ е н и е	при 278	нм;	О	— ф е р м е н т а т и в н а я активность			(одна единица
соответствует	активности	1	мг	Р Н К - а з ы /мл)	[31].
с возрастанием дозы,		а	затем превращается			в	компонент	П д
при дозах облучения,		превышающих			1 Мрад.	Компонент 1д		не

обнаруживается при облучении растворов в присутствии азота, когда с увеличением степени инактивации активный фермент 1 н почти полностью превращается в компонент П д . Этот компонент еще сохраняет небольшое количество ферментативной активно­ сти, которая в три раза выше после облучения в присутствии азота, чем после облучения на воздухе [19].

133

Молекулярный вес различных компонентов можно опреде­ лить по их относительному положению при элюции [35]. Для

максимумов		были получены следующие величины: 1Т1—14, 1д —
18—20, Пн —28			и Пд — 30—35		(см. рис. 67). Сравнительное ис­
следование		с	применением		аналитической ультрацентрифуги
показывает,		однако, что 1и и 1д — мономеры (MW= 14), в то вре­
мя как П и	и Пд —			димеры с молекулярным весом около 28 [31].
Поэтому 1	Д	и П д		элюируют с колонки раньше, чем можно было
бы ожидать		по их молекулярному весу. Это говорит о том, что

зги компоненты состоят из развернутых молекул, занимающих больший объем, чем нативные молекулы с таким же молеку­ лярным весом. Эти наблюдения позволяют объяснить принятую номенклатуру. Римские цифры обозначают число молекул в аг­ регате, а индексы н и д — нативные и денатурированные моле­ кулы.

Графики злюции, полученные для облученной сухой РНК-азы, схожи с графиками на рис. 67. В данном случае в присутствии кислорода получается денатурированный мономер 1д , который при облучении в вакууме образуется в незначительном

количестве. Во время	анаэробного	облучения большая	часть
нативной РНК-азы превращается		в денатурированные	агрега­
ты (13,21). Последние	состоят главным образом из димеров,

но при этом содержат также небольшое число тримеров, кото­

рые можно отделить			от димеров		хроматографическим			способом
							Т а б л и ц а 9
Аминокислотный		состав	компонента 1п		при облучении в водном растворе
(5 мг/мл) в азоте и в воздухе [31]
						Д о за облучения,		Мрад
Аминокислота	Теоретическое			Контроль	в	азоте	в	воздухе
		значение
					0, 5	1,0	0, 5	1,0
Аспарагин		15		14,81	14,87	14,74	15,08	14,85
Треонин		10		10,13	10,07	9,82	10,18	10,03
Серии		15		14,99	14,65	14,81	15,04	15,15
Глутаминовая		12		12,05	12,12	12,02	12,09	12,15
кислота							•
Глицин		3		2,98	3,21	3,73	3,37	3,50
Алании		12		12,01	12,00	12,02	11,79	11,64
Валин		9		8,82	8,83	8,82	8,81	8,89
1/2 Цистин		8		7,98	6,64	5,71	7,71	7,66
Метионин		4		3,77	3,63	3,43	3,55	3,32
Изолейцин		3		2,30	2,24	2,32	2,42	'2,23
Лейцин		2		2,03	2,06	2,07	2,08	2,07
Тирозин		6		6,12	6,40	5,41	5,26	4,88
Фенилаланин		3		2,92	2,89	2,73	2,84	2,70
Лизин		10		9,95	9,71	9,35	9,77	8,92
Гистидин		4		3,85	3,66	3,56	3,41	3,33
Аргинин		4		3,99	3,95	3,83	3,87	3,71
П р и м е ч а н и е .		Компонент состоит из ферментатнвно активной					Р Н К - а з ы .

134

на сефадексе при

рН = 2,1

[13].

Кроме того, во время облуче­

ния сухой РНК-азы образуются

агрегаты

высокого

порядка.

Этот факт подтверждается тем, что часть облученного

материала

становится нерастворимой

[21].

Несмотря на то, что такие физические свойства, как оптиче­

ское

поглощение,

скорость

седиментации,

электрофоретические

свойства

и

т. д.

компонента /1,.,

0,1

а

(см.

рис.

67)

не

претерпевают

о

сильных изменений [12] и компо­

нент

сохраняет

ферментативную

-0,1

t

t

активность,

он

содержит

некото­

279

287

рое

количество

поврежденных

1

_

l

1

!

аминокислот

(табл. 9)

и его

свой­

ства

изменяются

при

восстанов­

лении и окислении [12]. С другой

стороны,

между

денатурирован­

ными

компонентами

и

нативной

РНК-азой обнаружено множест­

во физико-химических различий.

Для

иллюстрации

этого

положе­

ния на

рис. 68,6

приводится

раз­

ница

между

оптическими

плотно­

стями

компонента

1п

необлучен-

300

ного

контроля

и

компонента

Пд ,

Длина

болны, нм

полученного при анаэробном об­

лучении

разведенного

раствора.

Рис. 68. Дифференциальный спектр:

Этот

«спектр

различий»

выяв­

а — о б р а з ц а Р Н К - а з ы

(денатурирован­

ляет

минимум

при

235;

279

и

ной . при

р Н = 1 . 4

н

нативной

при

р Н = 5 , 4 ) , измеренный

при

концентра­

286 нм.

ции

0,086%

и

длине

пути

светового

Сходная

кривая

получает­

пучка

1

см

[101; б — м е ж д у

компонен­

том П д

(0,5 Мрад

v-излучения в

ана ­

ся

после

кислотной

денату­

эробном

растворе,

концентрация

рации

РНК-азы

при рН=1,4

(см.

5 мг[мл)

и

компонентом

1„

необлу -

ченного

контроля,

измеренный

при

рис. 68, а),

после облучения

сухой

концентрации

1 мг/мл

и

длине

пути

светового

пучка

1

см

[20].

РНК-азы

[29]

и

растворов

РНК-азы, которые не были разделены хроматографически

по­

сле

облучения

[33].

Теперь

следует

рассмотреть,

почему

при

анаэробном

облуче­

нии образуется такое небольшое количество денатурированных

мономеров	(1д , см. рис.	67). Это	явление	можно	объяснить,
предположив, что процесс димеризации обусловлен					радикалами,
которые в	присутствии	кислорода	образуют перекисные ра­
дикалы:		М- + 0 2 - М О " .			(9.7)
Очевидно, что таким способом тормозится				димеризация, обус­
ловленная взаимодействием двух радикалов:
		М - + М - — М — М .			(9.8)

Реакция (9.7) невозможна в атмосфере азота и РНК-аза, согласно реакции (9.8), превращается целиком в денатурирован-

135

ный димер	( П д ) . Эти	рассуждения, по всей вероятности, при­
менимы и	к сухому	состоянию вещества, так как облучение

сухой РНК-азы дает картину элюции, подобную той, которую получают после облучения растворов. Остается, однако, нере­ шенным вопрос о том, происходит ли димеризация в сухом со­ стоянии или только при растворении материала. Имеются на­ блюдения, подтверждающие второе предположение. Как пока^- зывает аминокислотный анализ, сильнее всего снижается содер­

жание	аминокислот,		обнаруживающих радикальную группу
после	облучения	и способных		к взаимодействию с 3 H2 S	[30]
(см. разд. 9.3).		Кроме того, с		помощью ЭПР-спектроскопии не
удается обнаружить			радикалы	после облучения сухой РНК-азы
в атмосфере H2S		[17], так как		они взаимодействуют с H2S	еще

до окончания облучения. Согласно допущению, о котором упо­

миналось выше, в атмосфере H2 S агрегация молекул		не долж­
на иметь места [13].
9.6. Аминокислотный	анализ
Хроматографическое	разделение на сефадексе	различных

продуктов облучения РНК-азы дает возможность проводить раз­ дельный аминокислотный анализ отдельных компонентов и, та­ ким образом, выявить изменения в первичной структуре, которые отличают активные молекулы от неактивных. В этой связи осо­ бое значение приобретает анализ компонента 1п (см. рис. 67), который, согласно представлениям теории попадания, дол­ жен содержать только молекулы, не претерпевшие изме­ нений.

В табл. 9 приводится состав аминокислот нативного мономера 1Н после облучения растворов рибонуклеазы в атмосфере азота и на воздухе. Против ожидания обнаруживаются четко выражен­ ные изменения в составе аминокислот. После облучения в при­

сутствии азота уменьшается	содержание таких	аминокислот
как цистин, метионин, тирозин,	фенилаланин, лизин	и гистидин,

вто время как содержание глицина, напротив, увеличивается, хотя и очень незначительно. Это свидетельствует о том, что не­ которые поврежденные аминокислоты, теряя свои боковые цепи, превращаются в глицин. Облучение в аэробных условиях вызы­ вает разрушение тех же аминокислот. Исключение составляет один лишь цистин, содержание которого сильнее всего снижается

ванаэробных условиях, а в аэробной среде претерпевает лишь небольшие изменения. Эти данные показывают, что после облу­

чения в водных растворах молекулы компонента 1Н могут силь­ но изменяться, не теряя при этом своей ферментативной актив­ ности. Поэтому предположение, сделанное на основании экспо­ ненциальной формы кривых доза — эффект, о том, что инакти­ вация ферментов—-не что иное, как процесс «все или ничего», следует считать неверным..

136

В денатурированных мономерах и денатурированных димерах излучение поражает одни и те же аминокислоты (31). Селектив­ ный распад определенных аминокислот в растворе можно отне­

сти за счет различий в их константах скорости реакции			с вод­
ными радикалами. Эта корреляция особенно наглядна		в	случае
с цистином,	который обладает необычайно высоким	сродством
к е~ и при	облучении в атмосфере азота разлагается	быстрее,

чем другие аминокислоты. Эта реакция невозможна в присут­ ствии кислорода, поскольку увеличивается е~ , что ведет к обра­ зованию Ог. Именно поэтому при облучении в аэробных усло­ виях содержание цистина претерпевает незначительные изме­ нения. Другие аминокислоты, повреждаемые облучением, обыч­ но проявляют более высокое сродство с радикалом ОН', чем аминокислоты, не претерпевающие изменений [1]. Эта корре­ ляция, однако, не так очевидна, как в примере с цистином. Дан­ ные табл. 10, еще больше ограничивают роль этой гипотезы. При

									Т а б л и ц а		10
Аминокислоты ,		поврежденные при облучении РНК-азы
в	различных экспериментальных условиях
				К о м ­							Л и т е ­
	Состояние	Условия		по ­		Измененные		аминокислоты			р а т у ­
				нент '							ра
	Раствор			—	Cys	_	_	_	_	_	[3]
		Гелий			»	Met	Tyr	Phe	—	—	[15]
		Воздух		—	—	—	»	—	—	—	[33]
	»	»		—	Cys	Met	»	Phe	Lys	His	[32]
Раствор/атом		н 2		—	»	»	»	»	—	His*2	[16]
	водорода	Вакуум		—	»			—	—	—
Сухое состо­						»					[3]
	яние			—
	7>				»						[17]
	Радикалы	»		—	—	Met		Phe*2	Lys	His	[30]*3
	+ H , S									—
	Раствор	Азот		Гн	Cys*i	»	Tyr	Phe	»		[31]**
	»	Воздух		Ид	• Cys*i	»	»	»	»	»	[31]*4
				1н	Cys*2	»	»	»	»	»	[31]**
	»				Cys*2		»		»	* \	[31]*4
	»	Вакуум		fa­	Cys*2	»	»	t>	»		[21]**
	Сухое сос­			in	Cys	Met*2	»			»	[211**
	тояние
		»			»	»		D		»
	»			Ид							[21]**
	Сухое	о 2		1н	Cys	Met*2	Tyr	Phe	Lys	His	[21]**
	состояние
	»	о 2		1д	»	»	»	s			[21]**
	»	о 2	г	" д		D	»				[21]**
		77°	К	1н	»	»	- »	J>		»	[21]**
		77°	К	. Ид			»				[21]**

*' Значительное снижение .

**Небольшое снижение.

* 8 Снижение	содержания	еще в трех аминокислотах; пролине, йзолейцине н валине.
•* Повышение	содержания	глицина.

137

облучении разных компонентов сухой РНК-азы разрушаются те же шесть аминокислот, что и в растворе (21). Такую избира­ тельность не просто объяснить в терминах неодинаковой вероят­ ности реакции у различных аминокислот. Скорее следует допу­ стить, что в формировании конечного повреждения участвуют процессы переноса энергии и вещества (см. разд. 9.7).

Табл. 10 позволяет сравнивать изменения, наблюдаемые в аминокислотах различных компонентов, с изменениями, наблю­ даемыми в смеси активных и не­ активных продуктов облучения.

Полученная корреляция удовлет­ ворительна, если учитывать, в какой мере подразделение ами­ нокислот на интактные и повреж­ денные зависит от точности экс­ перимента и дозы облучения.

Зависимость

от

дозы

общего

числа

измененных

аминокислот

можно

определить

по

данным,

содержащимся

в

работах,

цити­

рованных

в

табл.

10.

Для

этого

Рис. 69. Суммарное количество по­

суммируют

экспериментально

по­

лученные

величины

для

цистина,

врежденных

аминокислот в

раз­

метионина,

тирозина, фенилала-

личных

компонентах

молекулы

нина,

лизина

и

гистидина

в

не-

РНК-азы:

к — активная

Р Н К - а з а ,

д —- неак­

облученном

контроле

и

получен­

тивные

продукты

облучения;

•

—

ное

значение

сравнивают

с

сум­

компонент 1„;

О — к о м п о н е н т

1д

и

11д при

облучении в сухом

состоянии

мой

величин

тех же

аминокислот

в

кислороде,

в вакууме

и

при

77° К;

в различных компонентах. Разли­

А — компонент

1,*;

А — компонент

1„

н

Д

чие в суммарных

величинах соот­

и

И д

при

облучении

в

растворе

ветствует

числу

поврежденных

(5

мг/ял)

на в о з д у х е

и в

азоте [21,

31|.

аминокислот. Изменение

в

содер­

жании

глицина

не учитывается, так как

увеличение

его количе­

ства происходит за счет разрушения других

аминокислот.

Не

учитывается также

и уменьшение

содержания

цистина

в

ана­

эробно облученных растворах РНК-азы, поскольку этот эффект вызывается селективным действием е~ .

На рис. 69 представлено общее число измененных аминокис­ лот в различных компонентах как функции относительной дозы

D/D37	(т. е. при изоэффективной инактивации фермента). Дан­
ное сопоставление приводит		к весьма любопытному результату:
все	величины, полученные	для компонента 1н , независимо от

того, облучалась ли РНК-аза в растворе, в вакууме, в атмосфере

кислорода или при	77° К, лежат		на одной прямой	(кривая н).
Это означает, что в этих		экспериментальных условиях			распад
аминокислот сопутствует		потере	ферментативной	активности,
хотя соответствующие D 3 7		различаются на 5000. Величины изме­
нений аминокислот,	полученные		для денатурированных		компо-

138

нентов 1 д и Пд , тоже располагаются на общей кривой, имеющей

тот	же	наклон, что и	кривая я, однако, в отличие от		первой,
данная кривая пересекает ординату у				1. Эта кривая,	конечно,
не	может	пройти через	D = 0, поскольку	вне облучения	денату­
рированный компонент			отсутствует.

В ферментативно активном компоненте на каждую инактивированную молекулу приходится 1,25 разрушенных аминокис­ лот (т. е. при £)/£>3 7 =1), в то время как денатурированные ком­ поненты содержат уже 2,26 поврежденных аминокислот. Это приводит к выводу о том, что разрушение одной из шести упо­ мянутых аминокислот инактивирует молекулу с вероятностью 0,4.5, в то время как в 55% случаев фермент сохраняет актив­ ность [21].

9.7. Механизмы инактивации

Данные, о которых шла речь в предыдущем разделе, мы теперь используем для интерпретации эффектов, вызываемых в ферментах ионизирующим излучением. Для того чтобы объяс­ нить специфику распада аминокислот (см. табл. 10) и данные ЭПР (см. рис. 65), необходимо допустить, что первичные по­ вреждения, вызываемые поглощением энергии излучения, хотя и распределяются вначале случайно по всей молекуле, в конеч­ ном итоге стабилизируются в удобном для этого месте благо­ даря внутримолекулярному переносу энергии, или перераспре­ делению. Эти участки—преимущественно двухвалентная сера или спаренные циклы [16]. Как правило, механизм реакции не за­ висит от типа первичного повреждения, что дает возможность объяснить, почему одни и те же аминокислоты изменяются при воздействии атомарного водорода в растворе и при облучении в растворе или в сухом состоянии в различных эксперименталь­ ных условиях.

Тот факт, что на единицу дозы при 77° К повреждается мень­ шее количество аминокислот, чем при комнатной температуре, можно объяснить тем, что при низких температурах происходит ослабление непрямого действия атомов водорода (см. разд. 7.2). Подобным же образом объясняется наблюдаемый факт, что число, а не тип изменений аминокислот зависит от присутствия кислорода. В соответствии с гипотезой, о которой шла речь в разд. 8.1, присутствие кислорода сильно тормозит реакции рести­

туции (8.2) и (8.3), что увеличивает общее				число	поврежденных
молекул.
Димеризация,	происходящая	в	результате		взаимодействия
двух радикалов,	ранее описана	в	разд. 9.5	[уравнение (9.8)].

Часть агрегации такого рода вызывается дисульфидным обме­ ном, показывающим, что радикал серы в остатке цистина взаи­ модействует с подобным повреждением в другой молекуле, со­ единяя таким способом две молекулы РНК-азы при помощи дисульфидного мостика. Об этом свидетельствует и тот факт, что

139