книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

(рис. 80). ДН К в вегетативных		клетках (£>3 7 =1,56 Мрад),			в че­
тыре раза чувствительнее	к облучению, чем ДН К			сухих	ана­
эробно облученных спор	( £ >37 = 6,3 Мрад).		Более высокую		чувст­
вительность ДН К во влажных		клетках можно отнести за			счет
водных радикалов (см. разд. 6.3). Однако			не исключено,		что и
кислород может вносить	свой	вклад в инактивацию вегетатив­
ных клеток. С другой стороны,		получены	величины	£)3 7 , равные

Х>100

>сГ

6

Iсо 10 Л

ос				2
в	\.			/DS7=6,JMpad
а 7				°
	•Ь	1
§-					О >4v
Ъ-0,1[	\	из?	ipoiww		^	Рис. 80. Инактивация				трапе­
зе	У	DS7=1,56Mpad				формирующей			ДИ К		Bacil
	\
^	*			1	1	lus subtilis		при	облучении
1			20			вегетативных			клеток		(/) и
					40
						сухих	спор		(2)	электрона­
			Доза,	Мрад
						ми с	энергией I			Мэв [31].
27 и	115 крад,		когда	в опытах	с облученными			клетками			или

спорами в качестве критерия использовалась их способность к

образованию колоний [31]. В данном		случае		различие			радио­
чувствительности также измеряется		фактором,			равным		четы­
рем.	В	целом		чувствительность
трансформирующей активности при­
мерно в 60 раз ниже, чем способ­
ность	образовать			колонии.			Отсюда
следует,		что	радиочувствительная
область при торможении						трансфор­
мации — не			что	иное, как			неболь­
шой участок ДН К примерно							такого
же размера,			что и маркер. Молеку­
лярный вес			мишени			индол ьно'го
маркера		В. subtilis,			определяемый
из £>з-, равной 6,3 Мрад,						составляет
примерно		100 000			[ср. уравнение
(5.5)].

Поток частиц,1013частиц/см2.

Рис. 81. Инактивация сухоп трансформирующей ДН К Diplococcus pneumoniae протонами с энергией 10 Мэв [8].

Однако экспоненциальные кри­ вые доза—эффект в опытах с трансформацией — скорее исключе­ ние, чем правило. На рис. 81 пока­ зана трансформирующая актив-

170

ность изолированной ДНК, облученной в сухом состоянии про­ тонами с энергией 10 Мэв. Отчетливо видно, что трансформи­ рующая активность сначала резко снижается, приближаясь при более высоких дозах к экспоненциальной зависимости. Такого

же рода

ответные реакции получены и в

опытах

с

другими

маркерами

и различными

вида­

ми излучений [8, 20]. Экспонен­

циальный

участок таких

кривых,

полученных

при

трансформации,

согласно

уравнению

(5.5),

дает

величины

MWT,

равные

пример­

но 2-105 дальтон, что приблизи­

тельно

соответствует

размеру

маркера {8, 14]. Так как индуци­

руемые

облучением

двухцепочеч-

ные разрывы также

немаловаж­

ны, следует подумать, нельзя ли

найти новый подход, который от­

ражал

бы

зависимость

вероят­

ности

трансформации

от

длины

молекулы

трансформирующей

Д Н К [4].

УФ-и з л у ч е н и е .

При

дей­

0

10

20

30.

ствии

УФ-излучения

картина

Время УФ-обучения,

мин

*

иная. Весьма любопытно,

что су­

Рис.

82.

Инактивация

стрептоми-

ществуют

маркеры,

одинаково

цинового

(/) и катомицинового

(2).

чувствительные

к действию

рент­

маркеров трансформирующей

Д Н К

геновского

облучения,

тепла, хи­

из

Heamophilus

influenzae

при

мических

веществ

и

ДНК-азы.

УФ-облучении [>-=254 ни;

интен­

Их УФ-чувствительность, однако,

сивность

1650 эрг/(см2-мин)]

[27].

различается

в 5—10

раз [20]. Было

также

обнаружено,

что

на­

клон кривой УФ-инактивации, полученной при трансформации,

непрерывно уменьшается с увеличением дозы,	т. е., в отличие
от случая с ионизирующей излучением, наклон	асимптотически

не приближается к экспоненциальной зависимости. Руперт и. Гудгал [27] показали, что кривые УФ-инактивации можно опи­ сать с помощью формулы

			N/Na=	1/(1		+ M > ) » .			(11.1)
Из этого следует, что прямую,						проходящую		через единицу,
мы получим в том случае, если					против дозы			УФ-облучения от­
ложить УNo/N.	Это		положение			подтверждается			эксперимен­
тально. Как видно,			например,		из	рис.	82,	иллюстрирующего
трансформацию	.резистентности				к	катомицину		и стрептомици­
ну у Haemophilus		influenzae,		такого рода график					имеет	то
преимущество,	что	различия		между			чувствительностью			двух

маркеров, зависящие в логарифмическом изображении от дозы,

могут	быть определены количественно с помощью коэффи-
циета	k в уравнении (11.1).

Теоретический подход. Задача теперь состоит в том, чтобы построить модель, описывающую этот необычный тип дозной зависимости действия радиации, который не встречался в пред­ шествующих десяти главах. Это сделать тем более необходимо,

поскольку подобные кривые доза — эффект	получены также
при действии на трансформирующую Д Н К	тепла,	азотистого
иприта, гидразина, гидроксиламина, диметилсульфата,		азотистой

Рис. 83. Схематическое изображение генетической рекомби­

нации	между молекулой		трансформирующей Д Н К (2),		не­
сущей	маркер	(М+), и	бактериальной	хромосомой	(1),
лишенной этого		маркера	(М~) [3].
кислоты и ДНК-азы		[3, 20]. Теоретическое		обоснование для ре­

шения этой проблемы предложено Бреслером с сотр. [3]. Суть

их гипотезы заключается в том, что первичной мишенью			является
вся молекула ДНК, а не ее	индивидульный	маркер.	Снижение
радиочувствительности при	увеличении дозы,	о котором можно
судить по излому кривой доза — эффект, объясняется			сокраще-,

нием эффективной длины рекомбинации вследствие случайного распределения радиационных повреждений. Это предположение оправдано, так как при анализе судьбы двух соседних марке­ ров число двойных трансформантов примерно равно числу кле­ ток, претерпевших одиночную трансформацию. Схема рекомби­ нации между молекулой трансформирующей Д Н К и хромосо­

мой бактерии приведена на рис. 83. В необлученном								состоянии
каждая рекомбинация, в которой участвует					маркер М, — залог
успешной	трансформации	(см. рис. 83,		А	и	С).	Трансформа­
ция не происходит совсем, если рекомбинация						включает радиа­
ционные	повреждения, так	как .при этом		образуется				нечто	по-
( добное летальной мутации		(В).	Следовательно, если					число	по­
вреждений в молекуле Д Н К возрастает				при		увеличении дозы,
то уменьшается число рекомбинаций, дающих						жизнеспособные
трансформанты.
Если	рекомбинационное		событие — явление				редкое,		ми­

шень может быть представлена как распределение расстояний между маркером и близлежащим повреждением. Вероятность рекомбинации при этом пропорциональна данному распреде­ лению (в своих расчетах Бреслер с сотр. [2] исходили из этой модели). Если же рекомбинация происходит сравнительно ча-

172

сто, что характерно для описанных выше бактерий, то транс­ формация наблюдается даже тогда, когда рекомбинации со­ вершаются по обеим сторонам от повреждения (см. рис. 83, С). В этом случае вероятность рекомбинации W описывается фор­

мулой Холдейна	[12] как	функция	длины рекомбинирующего
участка /;		7	г
W(0 = 4-0	— e-2 w 0-	( П - 2 )

После сложных расчетов было получено приближенное выра­ жение для скорости трансфор­ мации в этих условиях

где L — средняя		длина моле­
кулы	трансформирующей
ДНК; z— среднее			число	по­
вреждений	на	молекулу		и
1/со — генетическая			единица

длины. Так как z пропорцио­ нально дозе, эта формула со­ ответствует полуэмпирическо­ му выражению (11.1), посту­ лированному Рупертом и Гудгалом [27].

Если теорию Бреслера и соавторов применить к сцеп­ ленным маркерам, отстоящим друг от друга в молекуле Д Н К на достаточно большом рас­ стоянии, то следует ожидать, что скорость трансформации как функцию дозы можно опи­ сать уравнением

1/(1+££>)*. (11.4)

УФ-облучение, Ю^эрг/мм2

Рис. 84. Инактивация катомишшового

(/)н стрептомищшового (2) марке­

ров трансформирующей Д Н К из Haemophilus influenzae УФ-облуче- нием с Я=280 нм и «реактивация» последующим УФ-облучением с %=> =240 нм [28].

Экспериментально это было показано Рупертом [26], использо­

вавшим две пары сцепленных	маркеров у	Haemophilus in­
fluenzae. В его опытах индивидуальные маркеры			теряли транс­
формирующую способность в	соответствии	с	уравнением
(11.1).

Нам почти ничего неизвестно о типе повреждения, вызываю­ щего потерю трансформирующей активности, особенно в случае с ионизирующим излучением. Известно, что при УФ-облучении

инактивация	трансформирующей Д Н К связана с	образова­
нием димеров	тимина. Как уже указывалось в разд.	10.3, вы-

173

ход димеров выше всего при 280 нм, в то время как при 240 нм создаются благоприятные условия для расщепления димеров. Инактивация двух маркеров стрептомицин- и катоммцинрезистентности у Н. influenzae при 280 нм следует обычной, кривой доза — эффект (рис. 84). При повторном облучении (240 нм) благодаря расщеплению некоторой доли димеров тимина вновь возрастает трансформирующая активность. Тем не менее не всю инактивацию трансформирующей активности можно отне­ сти за счет УФ-пндуцированныхдимеровтнмина (см. разд. 10.3).

11.4. Затравочная активность ДНК
В разд. 11.1	речь шла о том, что синтез новой ДН К (репли­
кация) и РНК	(транскрипция) можно проводить	in vitro, ис­
пользуя Д Н К в качестве затравки. Для измерения		затравочной

Рис.	85.	Инактивация	затравочной	активности
Д Н К	тимуса теленка при синтезе РНК (/) и ДН К
(2)	(у-облучение С о 6 0 в фосфатном			буфере,
0,05	мг/ли)	[13].
активности облученная Д Н К			инкубируется	с ДНКили РНК-

полимеразой совместно с соответствующими нуклеозидтрифосфатами. Трифосфаты обычно метятся по Н3 , С 1 4 или Р 3 2 , а затем исследуется их включение в кислотонерастворимую фракцию нуклеиновых кислот. Такие опыты проводились Харрингтоном [13], использовавшим системы ДНК- и РНК-полимеразы. В обо­ их случаях кривые доза — эффект имели прогиб (рис. 85). За­ травочная ДНК, подвергнутая действию ионизирующего излуче­ ния в разведенном растворе, давала такую же ответную реак­

цию, как и	в опытах с трансформацией. Следует отметить, что
затравочная	активность облученной Д Н К		тимуса	примерно
в 40 раз чувствительнее при синтезе ДНК, чем РНК.				Различие
в -чувствительности двух этих		процессов	вполне	объяснимо,
если принять во внимание, что при синтезе			Д Н К считывается
целая молекула, в то время		как при синтезе молекулы Р Н К

174

копируются лишь ограниченные участки. Таким образом, ми­

шень для системы ДНК-полимеразы значительно

больше,

чем

для системы РНК-полимеразы.

Излом кривой доза — эффект

можно

объяснить

действием

трех механизмов.

1. Присутствуют мишени разного размера, что соответствует

неоднородности

распределения

молекулярного

веса

синтезиро­

ванной

иРНК

(см. разд. 11.1). Поскольку при

низких

дозах

преимущественно инактивируются

большие участки ДНК, кривая

доза — эффект

вначале резко падает, а в дальнейшем, с увели­

чением дозы, она становится

более пологой (см. рис. 6).

2. В результате облучения образуются новые области

свя­

зывания

полимеразы, которые,

однако,

не служат отправными

точками

для синтеза

РНК [33]. Предполагается, что

существует

л естественных отправных точек и что г новых

участков связы­

вания образуются во время облучения. Поскольку синтез

иРНК

начинается всегда только с исходных отправных

точек,

после

облучения он сокращается от А0

(количество

иРНК

в необлу-

ченном

контроле) до А, в зависимости от отношения

числа

ак­

тивных и общих участков связывания фермента

на

молекуле

ДНК:

А/А0

= п/(п-г).

(11.5)

Если считать, что я пропорционально

дозе,

это

выражение

можно

переписать,

используя

соответствующую

константу

k:

А/А0

= 1/(1 +

•

( П . 6 )

Следовательно, отложив А0/А

против дозы, получим прямую.

Ниже мы еще раз вернемся к этому вопросу.

3. Третья возможность рассматривается Хагеном

и др. [11].

Они считают, что облучение существенно не меняет число мест связывания. Вместо этого в ДН К индуцируются повреждения, прекращающие синтез РНК. Рассуждения, близкие к предполо­

жениям Бреслера	и др. [2], привели к выводу, что затравочная
активность Д Н К должна уменьшаться с дозой, согласно				урав­
нению (11.1) [10]. Это означает, что график		Ао/А	подчиняется
квадратичному закону. Из рис. 86 видно, что результаты				экспе­
риментов Хагена	с сотр. [11] можно описать	как линейным, так
и квадратичным	уравнением. Следовательно,	на	основе	такого

формального анализа кривой доза — эффект нельзя выявить раз­ личий между механизмами 2 и 3.

Для того чтобы определить, который из названных			механиз­
мов вносит наиболее существенный вклад в инактивацию				затра­
вочной активности, исследовали РНК, синтезированную				с по­
мощью облученной ДНК, а также способность фермента				связы­
ваться с этой ДНК. Как наглядно показано на рис. 87, а,				длина
синтезированных	цепей РН К	снижается примерно в	той		же
мере, что и общее	количество	вновь синтезированной	РНК		(см.

175

рис. 85),	в то время как число цепей существенно не меняется
(см. рис.	87,6). Следовательно, радиационное повреждение						за­
травочной	Д Н К	изменяет		синтез РНК таким		образом,	что
транскрибируется		не	весь	участок	целиком, а только его часть
от отправной точки			до следующего		критического	повреждения

	|	— I		I	i		I
v	0			10			20
			Доза,	крад
Рис.		86. Инактивация		затравочной		активности
Д Н К		тимуса теленка		при синтезе		РНК у-об-
лучением Со 6 0			в водном растворе		(0,5 мг/мл):
l	— A0/A-l+K,D		из уравнения (П . 6):			2 — Аа/А~0	+
+K:D)u		из уравнения
(ср. механизм 3). Тем не менее два других механизма								также
играют какую-то роль в			инактивации		затравочной активности.
Седиментация	Р Н К в градиенте сахарозы					показывает, что после,
облучения в	небольшой		дозе	число	больших		молекул	РНК

уменьшается быстрее, чем число больших молекул. Это под-,

тверждает	первую гипотезу. Кроме	того, облученная	в большой
дозе Д Н К	обладает повышенной	способностью	связывать

РНК-полимеразу,	что согласуется со второй гипотезой [18]. Од­
нако при низких дозах вклад		этого	эффекта в инактивацию
анализируемой функции Д Н К		сравнительно		невелик.
Какова же в таком случае		природа	критического		поврежде­
ния? В принципе	торможение	синтеза	Д Н К	может	вызываться
двухцепочечными	и одноцепочечными разрывами, повреждени­
ем оснований или	разрывом	водородных		связей.	Некоторые

176

(

данные о критическом повреждении можно получить, сравнив, затравочную активность различных препаратов Д Н К с их мо­ лекулярным весом (рис. 88). ДН К облучалась у- и УФ-кванта- ми либо разрушалась с помощью ДНК-азы или ультразвука. Эта необычная форма опыта дает возможность непосредственно оценить действие двухцепочечных разрывов на затравочную ак­

тивность,

поскольку

они, в

15

отличие от других првреж-

|

дений, приводят к

уменьше­

Ч

а

нию

молекулярного

веса.

о

На рис.

88

отсутствует

од­

I

нозначная корреляция меж­

ду затравочной

активностью

Д Н К

тимуса

и его

молеку­

лярным

весом.

Фрагмента­

§

1

,

ция Д Н К при действии

уль­

6

5

тразвука

существенно

нару­

3

шает

затравочную

актив­

а:

ность

только

при

низком

I

1

1

молекулярном

весе того же

порядка, что и у генетичес-

кого маркера. Поэтому двух-

"~

цепочечные

разрывы,

вызы­

ваемые ультразвуком,

нель­

зя считать

критическим

со­

бытием для торможения

за­

доза,

крад

травочной

активности. Не­

безынтересно

отметить,

что

Рис. 87. Длина и число молекул РНК,

результаты

обработки

уль­

синтезированных

на

облученной Д Н К

тразвуком

и

ДНК-азой

ло­

тимуса:

жатся на одну й ту же кри­

а — относительная длина

молекул

Р Н К . опре­

деляема,-! из

отношения

включенные

вую,

несмотря

на

то,

что

[8-С"]-АМФ и

гу-Р3 -]-АТФ; б — относительное

индуцированная

ДНК-азой

число

молекул

Р Н К . определенное

по вклю­

чению [\-Р3 2 1-АТФ в

Р Н К

1Ш.

деградация

обусловлена

на­

коплением одноцепочечных разрывов. Это свидетельствует

о том,

что одноцепочечные разрывы также не ответственны за инакти­ вацию затравочной активности. С другой стороны, представ­ ляется невероятным, чтобы нарушением водородных связей можно было объяснить потерю затравочной активности, посколь­ ку ДНК, полностью денатурированная теплом, все же сохра­ няет половину затравочной активности нативной молекулы, в то время как при облучении она может сокращаться до нуля.

Приведенные здесь доводы позволяют считать критическими повреждениями лишь такие типы изменения оснований, которые могут привести к инактивации Д Н К после УФ-облучения. Эта точка зрения подтверждается экспериментальными результа­ тами, согласно которым при данном молекулярном весе затра­ вочная активность в высшей степени эффективно инактивируется

177

УФ-излучеиием

(см. рис. 88). При этом

индуцируются

главным

образом поврежденные основания и крайне

редко

происходит

разрыв цепей. Природа критических повреждений при

действии

ионизирующего излучения полностью еще не раскрыта.

Име­

ются экспериментальные данные [33], подтверждающие

мнение

о том,

что

изменения

основа­

ний— это критические события

потери

затравочной

активно­

сти после Y-облучения. Дейст­

вительно,

одиоцепочечные

раз­

рывы при действии

ДНК-азы

не

оказывают

сколько-нибудь

значительного

влияния

на

за­

травочную

активность

Д Н К

(см.

рис.

88).

Однако

при

ферментативном

распаде

гид-

2

4

6

ролпзуется

лишь

фосфоди-

молекулярный

вес, 10вдапьтон

эфирная связь, в то время

как

Рис. 88.

Затравочная

активность

на

месте

разрыва, индуцируе­

(включение

АМФ в РНК) Д Н К ти­

мого облучения,

теряется

ли­

муса теленка в зависимости от моле­

бо

основание муклеотида,

свя­

кулярного

веса лосле

воздействия

занного

с

поврежденным

ос­

различных

агентов:

татком

сахара,

либо

весь

ну-

Y-облученне

С о ю

( • ) ;

УФ-облученне ( Д ) ;

Д Н К - а з а 1 ( # ) ;

ультразвук

( 0 ) [ Щ .

клеозид

[29]. Потеря

основа­

ния

в

сочетании

с

разрывом

цепи может быть причиной торможения транскрипции в облу­

ченной Д Н К [10].
11.5. Индукция фермента
Экспериментальное	исследование активности	Д Н К —не

единственный способ измерения инактивации процесса транс­ крипции. Удобным методом анализа транскрипции какого-то данного маркера может служить индукция фермента. Если, на­

пример, индуцировать синтез (3-галактозидазы	у Е. coli 15T_ L~,
то линейное увеличение количества фермента,	синтезированного

бактериями, наступает приблизительно после пятиминутного ла­ тентного периода (рис. 89). При увеличении дозы излучения уменьшается наклон линейного участка кривой (т. е. количе­ ство галактозидазы, синтезированной за единицу времени). При облучении в низких дозах (5,5 крад) наблюдается лишь незна­ чительное снижение скорости синтеза по сравнению с облучен­ ным контролем. Следовательно, если графически изобразить скорость синтеза как функцию дозы облучения, то мы получим кривую доза — эффект с отчетливо выраженным плечом. Ко­ личество фермента уменьшается, возможно, в результате нару­ шения процесса транскрипции. Как будет ясно из последую­ щего раздела, более поздние ступени синтеза фермента, т. е.

178

истинные ступени трансляции, гораздо устойчивее к действию облучения, чем индукция фермента. Эти данные подтвержда­ ются опытами Паули [22], показывающими, что скорость син­ теза белков, индуцированных ферментов и РНК у Bacterium cadaveris снижается экспоненциально с дозой облучения, при-

0	10	20	30
	Время	инкубации,	мин
Рис. 89. Инактивация у-облучением Сов0				В-галак-
тозидазной	активности,		индуцированной		у
Е. coli T _ L -	(количество галактозидазы			на	1 мл

бактериальной культуры определялось в различ­ ные промежутки времени после индукции или в зависимости от продолжительности инкубации в присутствии 5- Ю - 4 М тио-В-О-галактопиранозн- да) [23].

чем значение DS7 для торможения этих трех функций практи­ чески одинаково (около 30 крад). Отсюда следует, что действие облучения, по всей вероятности, первично блокирует синтез РНК, в то время как торможение связанного с ним синтеза белка не что иное, как вторичный эффект.

11.6. Гибриды ДНК —иРНК

Способность Д Н К образовывать гибриды с иРНК — еще одно характерное свойство ДНК, также связанное с транскрип­

цией.	Пример исследования	этого	свойства	приводится	на
рис.	90.
Робев и Маринова [25] смешивали облученную Д Н К					из
Е. coli В с РНК из того же		объекта,	меченную	с помощью	Р 3 2 ,