книги из ГПНТБ / Дертингер Г. Молекулярная радиобиология. Действие ионизирующих излучений на элементарные биологические объекты

анаэробном облучении все нерепарированные повреждения пер­ вого типа, подобно повреждениям второго типа, вносят свой вклад в инактивацию. В присутствии кислорода та часть по­ вреждений первого типа, которая не вступила в реакцию с кис­ лородом, но тем не менее осталась нерепарированной, не менее эффективна, чем все повреждения второго типа и необратимо' пероксидированные повреждения первого типа. Если вероятность того, что повреждения первого типа останутся нерепарированными, выражается величиной и, то уравнения (8.8) — (8.10) при­ нимают следующий вид:

		S(No) =	«ni-f-re2			и(т — O + l		,„
			—	^		- - = —		(8.12)
			Hi +		'l 2	" I
S (Oo)	=	" ( 1 — p) n1 + pn1		+ n2		и (1 —p) (in — 1) + P (m — 1) + 1
		Пл + По					in
								(8.13)
		_ S ( O s L				( 1 - й )
Если p	в	S(N S )		^	F	' u(m	— \) + \	уравнения
		уравнении	(8.14)		выразить		в терминах
(8.11), мы снова получим формулу Альпер. Однако								максималь­
ная сенсибилизация в			данном			случае описывается		уравнением
					и (/и — 1 ) + 1			(8.15)

Обобщение это, безусловно, можно рассматривать как очень грубое приближение к решению реальной задачи. Более гибкая гипотеза, очевидно, также должна допустить репарацию повреж­ дений первого типа, возникающих в аэробных условиях. Как, однако, будет показано в следующем разделе, даже простая гипотеза может объяснить многие из экспериментальных дан­ ных, полученных при изучении кислородного эффекта.

8.3. Кислородный эффект у бактерий

Особый интерес представляет вопрос о максимальной сенси­ билизации бактерий, т. е. величина т0 в формуле Альпер. Как

видно	из рис. 59, у	бактерий кислородный эффект				достигает
своего	максимального значения при			облучении	на	воздухе
(21%	0 2 ) . В соответствии		с уравнением	(8.15) кислородный эф­
фект увеличивается		при	возрастании	репарации	{и-+0), стре­

мящейся к верхнему пределу т, что действительно наблюдается при инактивации бактерий. Несколько предварительных сообра­ жений относительно молекулярной природы двух типов повреж­ дений помогут лучше понять это явление. Имеются многочис­ ленные данные о том, что, по крайней мере- у микроорганизмов,,

летальные события	представляют собой структурные изменения
в ДНК. Глубокие	нерепарируемые повреждения второго типа

120

могут в таком случае быть идентифицированы с разрывом в обе­ их цепях спирали ДНК. Труднее определить повреждения пер­ вого типа, которые в любом случае не единообразны, а пред­ ставляют собой конгломерат из одноцепочечных разрывов спи­ рали ДНК, повреждений оснований, локальной денатурации и т. д. (см. гл. 2).

						Т а б л и ц а 8
Кислородный			эффект	у бактерий [3]
	Штамм		h c r +	*		Штамм her	*
				m o			m o
Е. coli	В			2,7	B s - i		1,7
»	K12S			3,0	K12S, her-		1,7
»	С			3,1	CC4	( s y n - )	2,0
»	B/r,	WP 2		3,0	her—		1,7
В . subtilis		BS1 5		3,1	SMBL4		1,8
					SMBL5		2,3
P. aeruginosa			1 С	3,1	HCR5		2,4
					HCR	1 3	2,1
* m0 —максимальный				фактор кислородного эффекта бактериальных мутантов с			различной
способностью		к реактивации клеткой хозяина			(her).

В основе процессов реактивации лежит ферментативная ре­ парация одноцепочных разрывов и повреждений оснований, как

известно,	контролируемая		определенными		генами	(см.
разд. 13.6). У бактерий		существует		значительная	корреляция
между способностью к		репарации (her) и кислородным эффек­
том, что и описывается		уравнением		(8.15): мутанты hcr+		сенси­
билизируются сильнее,		чем	мутанты her- (табл.		8). Следова­

тельно, кислородный эффект прекрасно укладывается в схему инактивации бактерий. Он зависит от условий роста и инкуба­

ции бактерий (ср. [2]),	поскольку эти факторы могут влиять
на процессы ферментной	репарации.

В этой связи следует упомянуть, что бактериофаги также обладают кислородным эффектом, зависящим, как было только что сказано, от репарационной способности клеток хозяина. Тем не менее сенсибилизация в этом случае очень незначитель­ на и причины этого до сих пор неясны [12]. Однако хорошо вы­ раженный кислородный эффект достигается при внутриклеточ­ ном облучении фагов [9].

8.4. Кислородный эффект и ЛПЭ
Еще один способ проверить гипотезу кислородного	эффек­
та — исследовать его зависимость от ЛПЭ, что можно	обосно­

вать теоретическими доводами мишени: повреждения первого типа рассматриваются как «легкие». Отсюда следует, что для их образования требуется небольшое, иногда точно фиксируемое

121

количество энергии. Если отложить на графике радиочувстви­ тельность (1/^)37) против ЛПЭ, то, согласно теории мишени, для этого типа повреждений получим кривые без максимума. Если же нерепарируемые «тяжелые» повреждения второго типа связа­ ны с редкими индивидуальными актами передачи больших ко­ личеств энергии, аналогичное графическое изображение долж­ но привести к кривым с максимумом. Так как общее поврежде­ ние включает оба типа, то получим совпадающие кривые, при­ чем стремление кривых иметь максимум становится менее

¥\	. Ог	о
		о
		N. °
t3

§ 4 '

1 i 1 ? 11 ш				Вклад		8-частиц'
			1	1 1 1 1 н и		1 1 1 1 1 H I
10		10г			103		10*
		„ЛПЭ,			Мэд-сн2-г-1'-
Рис.	60.	Зависимость			радиочувствительно­
сти	(I/D37)		бактерий		Shigella		sonnei от
ЛПЭ	в	аэробных		и анаэробных			условиях
[4].

выраженным по мере увеличения относительной значимости по­

вреждений первого типа. Эти условия		действительно выпол­
няются, например, у чувствительных		бактерий	и при
облучении в присутствии	кислорода.	Это явление	подтверж­
дается данными рис. 60.	«
Как и следует из приведенных рассуждений, через			максимум

проходит анаэробная кривая, а не кривая, полученная в присут­ ствии кислорода. Более того, из рис. 60 видно, что величина кислородного эффекта уменьшается с увеличением ЛПЭ, по­ скольку частота тяжелых поражений второго типа увеличивается при более высоких значениях индивидуальных актов локальной Передачи энергии. В этих условиях образование повреждений первого типа предпочтительно вызывается присутствием б-излу­ чения соответствующей энергии, существование которого не дает фактору кислородного эффекта исчезнуть даже при высоких значениях ЛПЭ. В данном случае зависимость от ЛПЭ правиль­ но описывается гипотезой, поскольку высокие значения ЛПЭ не

противоречат положению, при котором пг—1^-0.		Следовательно,
S(N2)	уравнения (8.12) приближается к S(02)	уравнения (8.13).
Кроме	того, вероятность и нерепарированных повреждений

всегда умножается на т—1, и репарационная способность ста­ новится незначительной при высоком ЛПЭ (т—1->-0), т. е. при высоких значениях ЛПЭ больше не существует различий в чув-

122

ствительности между устойчивыми и чувствительными мутан­ тами. Это подтверждается также данными рис. 61. Как и сле­ довало ожидать, максимум исчезает при снижении репарацион­ ной способности (и—>-1). Кроме того, при увеличении ЛПЭ сокращается разность между радиочувствительностью различ­ ных мутантных штаммов.

	П\	I I I	t l l	1	I I	I I I I	I I I	I I	I I I I I I '—i	L
			1	'	'	10			100
						/1ПЭ,	кэв/мкм
	Рис.	61.		Зависимость			радиочувствительности
	{l/D'31)		различных мутантов Е. coli от ЛПЭ
	данного вида излучения [14]. Определение до­
	зы Д'зт		см. в разд.			13.2.
Два эти примера показывают, что гипотеза, даже в упро­
щенном	виде, правильно				описывает			не	только	кислородный
эффект,	но также		и	чувствительность				бактерий		в зависимости

от ЛПЭ. Несмотря на очевидную приемлемость гипотезы кис­ лородного эффекта для приведенной выше серии экспериментов, еще раз следует подчеркнуть, что основное деление -повреждений

на два типа, в	начале	чисто эвристическое, преставляется нам
крайне упрощенным. Помимо результатов;			представленных в
гл. 10, необходимо упомянуть серию опытов			Пауэрса с сотр.
Они облучали	споры	Bacillus megaterium	в разнообразных

газовых условиях и затем переносили^ их на какое-то время в разные газовые среды, прежде чем привести в контакт с воз­ духом для биологического исследования. На основании различий в выживаемости они воссоздали «профиль радиочувствительно­ сти» [16], показывающий, что существуют разные типы кисло-

123

родозависимых повреждений, среди которых имеются долгоживущие радикалы, вызывающие «эффект последствия» при изме­ нении среды после облучения. Поэтому ясно, что допущения, ка­ сающиеся повреждений, лежащих в основе кислородного эффек­ та, слишком упрощены, о чем не следует забывать при примене­ нии гипотезы, представленной здесь в ее основном варианте.

ЛИ Т Е Р А Т У Р А

1.Alper Т. Radiation Res., 1956, 5, 573,

2.Alper Т. Int. J. Radial. Bio!., 1961, 3, 369.

3. Alper T. Mutation Res., 1967, 4, 15.

4.Brustad T. Radiation Res., 1961, 15, 139.

5.Brustad T. Radiation Res., 1966, 27, 456.

6.	Giinther W., Jung H. Z. Naturforsch.,			1967, 22b, 313.
7.	Howard-Flanders	P.	In: Advances	in	biological and		medical	physics.
	Vol. V I . Eds.	C. A. Tobias and J.			H. Lawrence.	New	York,	Academic
	Press. 1952, p. 533.
8.	Howard-Flanders	P.,	Alper T. Radiation		Res., 1957, 7, 518.
9.	Howard-Flanders	P.,	Jockey P. Int. J.		Radiat. Biol.,	1960, 2, 361.

10.Hutchinson F. Radiation Res., 1961, 14, p. 721.

11.Hutchinson F., Watts E. Ibid., p. 803.

12.Ikenaga M . Radiation Res., 1968, 34, 421.

13.Jung H., Schussler H. Z. Naturforsch., 1966, 21b, 224.

14.Munson R. J. e. a. Int. J. Radiat. Biol., 1967, 13, 205.

15.Oksmo O., Brustad T. Z. Naturforsch., 1968, 23b, 962.

16.Powers E. L., Kaleta B. F. Science, I960, 132, 959.

г п A R А о ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФЕРМЕНТЫ

Задача предшествующих глав состояла в том, чтобы выявить основные характерные черты, а также общие «законы» действия излучения, что дает реальную основу для понимания «биомоле­ кулярной» части данной монографии. Хотя наш анализ начи­ нается с исследования действия излучения на ферменты, это не следует воспринимать как доказательство простоты данного рода явлений. Структура ферментов в некотором роде даже более сложная, чем структура нуклеиновых кислот, а их трехмерное строение отражает высокоспецифические каталитические свой­ ства этого вида молекул. Интерес к влиянию излучения на фер­ менты объясняется тем, что они шфают важную роль в поддер­ жании жизненных процессов. В этой главе сделана попытка на основе множества разнородных наблюдений составить пример­ ную картину действия излучения на ферменты. Однако наш ана­ лиз ограничивается главным образом хорошо изученным фермен­ том — РНК-азой, поскольку количество и разнообразие сущест­ вующих экспериментальных данных не позволяют дать обоб­ щенное описание действия излучения на различные ферменты.

9.1. Структура и функция РНК-азы
Последовательность	аминокислот в РНК-азе известна	с
1959 г. Молекулярный	вес РНК-азы — 13 680, й состоит она	из

124 аминокислот, объединенных в одну цепь (рис. 62), сохраня­ ющую свою компактную форму в пространстве при помощи че­ тырех дисульфидных мостиков. Лишь сравнительно недавно Карта с сотр. [22] определили пространственную ее структуру (конформацию). Структура поддерживается не только дисульфидными мостиками, но также водородными связями между амино- и карбоксильными группами, электростатическими сила­ ми и гидрофобными связями. В образование гидрофобных свя­ зей вовлечены аминокислоты с неполярными боковыми цепями и невысоким сродством к воде. В пространственной конфигура­ ции они стремятся как можно ближе подвинуться к внутренней части молекулы, но как только значительное количество этих

125

групп приходит в тесное соприкосновение, образуются гидро­ фобные связи, увеличивающие стабильность коиформации.

Последовательность индивидуальных аминокислот достаточ­ но однозначно определяет конформацию молекулы. Это, напри­

мер,

выявляется

в опытах,

где

фермент

денатурируется теплом

или

химическими

агентами,

вызывающими

разворачивание

молекулы.

В

случае

с

РНК-азой

эта

денатурация

обратима,

5 ^ 6

1

8

9

Ю

11

К

13

М

15

IS 17

18 19

20

/

,№ —Ala —Lys—Ptie

-Olu— Arg—в£и^His^Met-~Asp--Ser-~Ser—Thr-~Ser —Ata—Ato

4\А1аГ

3

Z

53

52

51

50
*y \^ -	^~Val^Pht~Thr~Asp~Vat~Pro^Lys^Cys~Arg~Asp~^~Thr^Leu~Mp~Arg-^32
AS 47	46 45 44 43 42 ° 4 / 4(7 39 38 37 38 35 34 33

Рис. 62. Первичная структура РНК-азы с дисульфидными мостиками [34].

даже когда восстанавливаются дисульфидные связи. Молекула тогда становится ферментативно неактивным полипептидом, лишенным третичной структуры и содержащим восемь SH-rpynn.

Однако на воздухе она может вновь		спонтанно	окислиться и
вернуться	в состояние первоначальной	конформацин.
Свое	название РНК-аза получила	благодаря	способности

вызывать деградацию РНК. Эта деградация осуществляется в две стадии. Первая стадия состоит в ращеплении фосфодиэфирной связи и переносе эфирной связи на 2'-гидроксильную груп­ пу рибозы, с тем чтобы образовать циклический диэфир. На вто­ ром этапе эта пиримидин-2', З'-циклическая фосфатная связь гидролизуется до нуклеотид-З'-фосфата. Используя РНК в ка­ честве субстрата, можно исследовать общую реакцию, а с по­ мощью цитидин-2', З'-циклофосфата наблюдают одну только вторую реакцию. В случае, когда упоминается ферментативная активность, речь идет об общей реакции, где в качестве субст­ рата использовалась РНК.

9 2. Кинетика инактивации

РНК-аза, подобно большинству других ферментов, дает эк­ споненциальные кривые доза — эффект, независимо от того, про­ водилось ли обучение в сухом состоянии или в растворе (см.

126

рис. 54, 63) или же инактивация была вызвана атомарным водородом [16, 18]. Из рис. 63 видно, что обе функциональные единицы РНК-азы одинаково чувствительны к облучению в растворе. Тот же результат' был получен Дирингом [7] после УФ-облучения сухой РНК-азы. Напротив, эстеразная активность химотрипсина [2] и трипсина [4] оказалась более радиочувст­ вительной, чем протеазная. Од­ нако вопрос о радиочувствитель­ ности отдельных функциональных единиц фермента еще далеко не решен (см. рис. 40).

Молекулярный

вес

мишени

для

инактивации

многочисленных

сухих

ферментов

вычислен

с

по­

мощью D 3 7

(см. разд. 5.2).

Срав­

нение

с

истинными

значениями

(см. рис. 28)

показывает, что

они

хорошо

согласуются

между

со­

бой.

Отсюда

можно

заключить, .в 8

что

радиочувствительность

фер­

Доза, 10гкрад

мента

возрастает

с

увеличением

его

размера

и что

фактически

Рис. 63. Инактивация РНК-азы в

каждое событие потери

энергии в

0,5 М

.растворе

KCl

(1

мг/мл)

60 эв

(первичное событие или

рой

у-излученнем Со6 0 .

Потеря фер­

ионов),

в

какой

бы

части

моле­

ментативной активности

опреде­

ляется

с помощью двух

различ­

кулы

оно

ни

происходило,

ведет

ных субстратов: Р Н К

( • )

и шж-

к ее инактивации.

В течение дли­

лоцитидинфосфата

(о)

[33].

тельного

периода

времени

толко­

вание

этого

явления

вызывало затруднение, поскольку в

моле­

куле фермента различные изменения можно вызывать химиче­ ским путем без непременной потери активности.

При определении радиочувствительности ферментов по на­ клону кривых доза — эффект необходимо удостовериться в том, что поврежденные и неповрежденные молекулы обладают оди­ наковым сродством к субстрату. Любое различие означало бы, что скорость инактивации есть функция концентрации субстрата и что экспериментально определяемая радиочувствительность поэтому будет зависеть от количества использованного субстра­ та. Эта задача решается сравнением постоянных Михаэлиса— Ментена для облученных и необлученных образцов. Согласно теории Михаэлиса о кинетике действия фермента, скорость ре­ акции v описывается уравнением

	:\S]		(9.1)
	K,n+[S\	'
	где [S] — концентрация субстрата;	Кт	— константа Михаэли­
	са—Ментена и Умакс — максимальная		скорость реакции, опре-

127

деляемая опытным путем. В соответствии с предложением Лайнуивера и Берка [23] уравнение (9.1) можно записать в виде

	_ L _ . * * _ . _ » _ + _ L _ .								( 9 . 2 )
	V	"макс			[S]	"макс
Следовательно,	откладывая		l/v		против		1/[5], получим прямую
(«график Лайнивера—Берка»).					Экстраполяция				прямой до
® = оо (т. е. 1/и = 0) дает
		1 / [ 5 ] и = 0 О		=	- 1 / 7 С П 1 .				(9.3)
-
					28,1Мрад/
а;			X			14>1		t*-^^
-
		if		i*-^^				---^——•—
	^	^ ^ ^	^ ^	Л	Г '	^	Контроль
-0,5	О		1			1		1	2,0
			0,5			1,0		1,5
\*~1/Кт - Ц		Концентрация субстрата, ммоль1
Рис. 64.	График	Лайнуивсра — Берка					для	определения
константы Мнхаэлнса — Ментена						Кт	и	максимальной
скорости реакции после уоблучения РНК-азы в атмос­
фере кислорода		[17].

Отрезки, образующиеся при пересечении абсциссы и орди­ наты, соответствуют величине, обратной константе Михаэлиса — Ментена и 1/имаксРис. 64 иллюстрирует приложение этого ме­ тода к сухой РНК-азе, подвергнутой действию у-излучения в присутствии кислорода. По мере увеличения степени инактива­

ции и М акс уменьшается,	поскольку сокращается количество ак­
тивного фермента, тогда	как величина Кт		от дозы не	зависит.
Это свидетельствует о том, что		облученная	РНК-аза	обладает
тем же сродством к субстрату,		что и необлученный		фермент.

Аналогичный результат был получен и для РНК-азы, облучен­ ной в вакууме [17] и в водных растворах [33].

В противоположность этому при облучении в растворе вели­

чина .D37 для ДНК-азы [27]	или	химотрипсина	[24] не зависит
от концентрации, в то время	как	действие атомарного водорода
на раствор химотрипсина не	меняет сродства		к субстрату [25].

J 28

9.3. Индуцированные облучением радикалы

Рассмотрим молекулярные изменения облученных фермен­ тов. Лучше всего начать с анализа радикалов, образующихся в результате облучения сухих ферментов. Как и многие другие

органические радикалы, они в течение

длительного

времени

устойчивы при комнатной температуре и

легко наблюдаются с помощью ЭПР.

-2,006

Прежде всего

произведем

качествен­

ный

анализ

спектра

ЭПР

ферментов с

серусодержащими

аминокислотами,

таки­

ми,

как

цистин,

цистеин и

метионин. К

этой группе относятся РНК-аза, трипсин,

253°к

лизоцим и пепсин. В опытах с этими фер-

ментами

сделано

интересное

наблюдение

(рис. 65). Если РНК-аза облучается при

77° К, то

при

этой

температуре

регистри­

руется широкая асимметричная линия ре­

зонанса

(по техническим

причинам

запи­

сывается

первая

производная

этой ли­

нии в том виде, как представлено на ри­

сунке) . Этот

неспецифический

спектр •—

3 6 5 ^

следствие вклада

радикалов

различного

"

типа в сигнал ЭПР, получаемого при низ­

ких

температурах,

поскольку

радикалы

образуются

при

случайной

абсорбции

энергии в разных частях молекулы. Если

тот же образец нагревать до

комнатной

Рис^

65.

Спектр

ЭПР

температуры,

то

форма

сигнала

изме­

РНК-азы

после

облуче­

нится. Через

несколько минут

или

часов

ния

при

7Т К,

измерен­

сигнал благодаря

наложению

не

менее

ный

при разных

темпера­

двух

компонентов

принимает

характер­

турах [6].

ный вид. Один из этих компонентов — дублет, из чего можно

за­

ключить,

что данный

компонент обязан своим

происхождением

а-водороду в полипептидной цепи.	Поскольку полиглицин и про­
стые глицинсодержащие пептиды	дают тот же	спектр, то его,
как правило, связывают с радикалом
Н	О
-NI — С - — СII — .		(9.4)
I
Н

Это предположение, однако, нуждается в подтверждении, поскольку другие полиаминокислоты тоже дают дублеты [8]. Второй компонент представляет собой небольшой пик, расши-

5

Г. Дертннгер, X . Юнг

129