контроль качества и безопасность ЛП

7.ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ВАНАЛИЗЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

7.1. Хроматографические методы

Хроматографией называется процесс разделения, в котором определяемое соединение распределяется между подвижной (жидкой или газовой) и неподвижной (твердой или жидкой) фазами. При этом происходит концентрирование разделяемых веществ. Хрома- тографические методы широко используются в анализе ЛВ благодаря своей универсаль- ности, высокой избирательности и чувствительности аналитических определений. Среди различных вариантов хроматографии в фармацевтическом анализе широко применяются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газожидкостная (ГЖХ) и пла- нарная хроматография.

7.1.1.Высокоэффективная жидкостная хроматография

Вжидкостной хроматографии подвижной фазой является жидкость. Метод ВЭЖХ ха- рактеризуется более широким кругом анализируемых объектов, по сравнению с газовой хроматографией, поскольку большинство веществ не обладает достаточной летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах и при переведении в газообразное состояние разлагаются.

Особенности различных вариантов жидкостной хроматографии обусловлены физико- химическими свойствами жидкой подвижной фазы. При этом селективность определяется природой подвижной (элюент) и неподвижной (адсорбент или жидкость) фаз. Большой выбор элюентов позволяет в широком диапазоне варьировать параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Некоторые жидкостные хроматографы пре- дусматривают применение градиентного элюирования.

Внастоящее время применение сорбентов с размерами зерен 10–30 мкм, поверхностно-

иобъемно-пористых сорбентов с размерами частиц 5–10 мкм, нагнетательных насосов и высокочувствительных детекторов обусловило переход к ВЭЖХ.

Широкое применение ВЭЖХ в аналитической практике привело к дальнейшему раз- витию хроматографических методов анализа. Быстрый массоперенос при высокой эффек- тивности разделения позволяет использовать ВЭЖХ для разделения и определения ве- ществ, содержащих нейтральные молекулы (адсорбционная и распределительная хрома- тография), ионов (ион-парная хроматография), а также высокомолекулярных соединений по фракциям (эксклюзионная хроматография). Методами аффинной и лигандообменной хроматографии разделяют биологически активные вещества и оптические изомеры.

Вадсорбционном варианте ВЭЖХ в зависимости от полярности неподвижной и под- вижной фаз различают нормально-фазовую (НФ) и обращенно-фазовую (ОФ) хромато- графию. В НФ ВЭЖХ применяют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФ ВЭЖХ – неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы. В обоих вариантах принципиальное значение имеет выбор подвижной фазы. Неподвижная фаза удерживает разделяемые вещества, подвижная фаза (растворитель или смесь растворителей) обеспе- чивает различную емкость колонки и эффективное разделение компонентов смеси.

Адсорбенты различных типов (полярные и неполярные) характеризуются неодинако- вой селективностью по отношению к разделяемым соединениям. В качестве адсорбентов

применяются тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м2/г.

Полярные адсорбенты (оксиды кремния и алюминия, флорисил и др.) содержат на по- верхности слабокислотные ОН-группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты применяются в методе НФ ВЭЖХ для разделения соедине- ний со средней полярностью.

Основной недостаток полярных адсорбентов – высокая чувствительность к содержа-

111

нию воды в растворителе. Например, силоксановые группы ≡Si–О–Si≡ на поверхности ок- сида кремния в присутствии воды переходят в силанольные группы ≡Si–ОН, при этом изменяются свойства поверхности и результаты становятся невоспроиз- водимыми (рис. 10).

1		O H		2			3
O H	О	Si	О			О		O H
				Si
	Si	О			О		Si О
								Si
				О
Н	О	О					О	О
		О				О
	Si
О

Рис. 10. Активные группы на поверхности силикагеля:

1 – связанные водородной связью силанольные группы, 2 –свободные силанольные Si–OH, 3 – силок- сановые Si–O–Si

В методе ВЭЖХ применяют полярные сорбенты с привитыми полярными группами (амины, диолы), что позволяет изменять селективность определения подбором соответст- вующего элюента (рис. 11). Неполярные адсорбенты проявляют селективность к поляр- ным соединениям. Применимы также сорбенты с привитыми неполярными фазами, на- пример силикагель с алкилсилильными группами. Экранирование силанольных ОН-групп силикагеля проводится с помощью алифатических углеводородов С3 и С4, однако получить относительно большие емкости колонки и объемы удерживания удается только при вве- дении более длинных алкильных цепочек, например С18. Кроме перечисленных непод- вижных фаз, применение находят поверхностно-пористые носители. Это жесткие непо- ристые носители (например, стеклянные шарики), покрытые тонким пористым слоем ак- тивного полярного или неполярного сорбента. Поверхностно-пористые носители оказы- вают малое сопротивление потоку, вследствие чего возрастает скорость анализа.

R

(CH2)3NH2

R

(CH2)7CH3

O

Si

O

Si

R

R

амино, NH

октил, C8

2

O

Si

R

(CH2)3CH3

R

(CH2)17CH3

O

Si

R

R

бутил, С4

октадецил, C

18

R

R

O

Si

(СH2)3CN

O

Si

(CH2)3

R

R

циано, нитрил

фенил

R

R

CH

O

Si

(СH2)5CH3

3

O

Si

(CH2)3

N

+

CH Cl-

R

R

3

CH3

гексил, C

6

анионообменная

R

R

O

Si

CH3

O

Si

(CH2)3SO3-H+

R

R

метил,

C

катионообменная

1

112

Рис. 11. Состав типичных модифицированных фаз в ВЭЖХ

Эффективность колонки тем выше, чем уже´ получается пик при том же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок (ЧТТ) N: чем выше эффективность, тем больше ЧТТ, тем меньше расширение пика по мере его прохождения через колонку, тем уже пик на выходе из колонки. ЧТТ легко определить их хроматограммы по следующей формуле:

N = 5,54(tR/W1/2)2.

Селективность колонки определяется отношением приведенных времен удерживания двух пиков. Временем удерживания пика называют время между нанесением пробы на колонку и выходом из нее пика, соответствующего компонента разделяемой смеси

S = (tR2 – t0)/(tR1 – t0)

где t0 – время удерживания несорбируемого компонента; tR1 и tR2 – времена удерживания компонентов 1 и 2 соответственно.

Селективность колонки зависит от многих факторов. Искусство экспериментатора в большей мере определяется умением воздействовать на селективность разделения пра- вильным выбором химической природы сорбента, состава растворителя и учета химиче- ской структуры разделяемых компонентов. Иногда заметное влияние на селективность оказывает изменение температуры колонки, в результате чего меняются коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами.

При оценке разделения двух компонентов на хроматограмме важным параметром яв- ляется разрешение RS, которое связывает время выхода и ширину пиков обоих разделяе- мых компонентов:

RS = 2(tR2 – tR1)/(W1 + W2).

Разрешение увеличивается по мере возрастания селективности, ключевую роль в этом играет коэффициент разделения, который необходимо предельно повысить при помощи соответствующего выбора подвижной и неподвижной фаз и условий разделения.

Важным параметром удерживания в жидкостной хроматографии является коэффици- ент емкости k, определяемый как частное от деления массы вещества в неподвижной фа- зе на массу вещества в подвижной фазе:

K = mн/mп.

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на колонке, коэффициент емко- сти должен быть больше нуля, т.е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости не должен быть слишком большим, чтобы по- лучить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана непод- вижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики ана- лиза заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном слу- чае различные для всех компонентов, но не очень большие по значению коэффициенты k. Этого добиваются, изменяя элюирующую силу растворителя (полярность). Полярность растворителя определяется суммарным эффектом всех типов межмолекулярного взаимо- действия (дисперсионного, индукционного, донорно-акцепторного и диэлектрического) между растворителем и растворенным веществом.

Большое внимание уделяется выбору подвижной фазы (элюента), поскольку она ока- зывает решающее влияние на селективность разделения компонентов, эффективность ко- лонки и продолжительность анализа. Подвижная фаза должна растворять анализируемую пробу, характеризоваться малой вязкостью (коэффициенты диффузии компонентов анали- зируемой пробы должны быть достаточно большими), компоненты пробы не должны раз- рушаться в ходе анализа. Растворители, входящие в состав подвижной фазы, должны быть инертными к материалам всех узлов хроматографа, безопасными для человека, адаптиро- ванными к данному детектору и доступными.

113

Элюирующая эффективность подвижной фазы определяется полярностью растворите- ля. В НФ хроматографии с увеличением полярности растворителя его элюирующая эф- фективность возрастает, в ОФ варианте – снижается. Растворители, расположенные в по- рядке возрастания их элюирующей эффективности, составляют элюотропный ряд. В жид- костной адсорбционной хроматографии предложен элюотропный ряд Снайдера (в скобках приведена элюирующая эффективность растворителей): пен тан (0) < н-гексан и н-гептан (0,01) < циклогексан (0,04) <тетрахлорметан (0,18) < бензол

(0,32) < хлороформ (0,38) < ацетон (0,51) < этанол (0,88) < вода (>>1).

Для решения практических задач применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Незначительные добавки второго растворителя, особенно воды, существенно уве- личивают элюирующую эффективность подвижной фазы; это характерно, например, для смесей воды с ацетонитрилом.

Вслучае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропа- нола) увеличивают, повышая содержание в нем полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, снижая содержание изопропанола. Если содержание полярного ком- понента становится слишком малым (0,1%), следует заменить его более слабым по элюи- рующей силе. Так же подбирают растворитель в случае использования привитых поляр- ных фаз (нитрильной, амино-, диол-, нитро- и др.), учитывая возможные химические ре- акции и исключая опасные для фазы растворители (альдегиды и кетоны для аминофазы).

Вслучае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила), и умень- шают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, исполь- зуют другую органическую составляющую или пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделении сложных биологических смесей часто не удается подобрать силу рас- творителя таким образом, чтобы все компоненты разделялись и элюировались за короткий срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т.е. использовать рас- творитель, элюирующая сила которого в процессе анализа изменяется – постоянно увели- чивается по заранее заданной программе.

Для идентификации компонентов анализируемой смеси необходимо точное фиксиро- вание параметров удерживания веществ, выходящих из колонки; как правило, для этого измеряют объем или время удерживания.

Количественная жидкостная хроматография является хорошо разработанным анали- тическим методом, не уступающим по точности количественной газовой хроматографии, значительно превышающим точность тонкослойной хроматографии и электрофореза.

Количественный анализ состоит из следующих стадий:

– хроматографическое разделение;

– измерение площадей или высот пиков;

– расчет количественного состава смеси на основании хроматографических данных;

– интерпретация полученных результатов (статистическая обработка).

При проведении анализа (особенно неустойчивых веществ) необходимо свести к мини- муму ошибки, которые могут быть допущены при отборе проб, экстракции, выделении, очистке и др.

Образцы должны быть полностью растворены, а их растворы приготовлены с точно- стью ±0,1%. Растворять образец желательно в подвижной фазе, что исключит возмож- ность осаждения его в колонке. Если растворение в подвижной фазе невозможно, следует применять растворитель, смешивающийся с ней.

Вхроматографическом разделении веществ также могут возникнуть осложнения (при неправильном выборе условий хроматографии), что приведет к разложению или превра- щению веществ во время анализа, или необратимой адсорбции вещества на данной колон- ке. Важно убедиться в отсутствие этих нежелательных явлений и при необходимости про- вести регенерацию колонки или заменять ее.

Внастоящее время для обработки хроматограмм используются методы с различными

114

интeграторами и ЭВМ. Подобные системы точны, экономят время, позволяют корректи- ровать смещение базовой линии, учитывают время удерживания. Они выводят на печать полное сообщение, включая содержание, и находят широкое применение особенно при серийном анализе.

Для количественного хроматографического анализа используют различные методы калибровки.

Метод внешнего стандарта или абсолютной калибровки. В хроматограф вводят оп-

ределенный объем каждого стандартного раствора и измеряют площадь или высоту пика. Для каждого вещества строят график зависимости высоты или площади пика от концен- трации или массы вещества. Если калибровочный график линеен и проходит через начало координат, то калибровочный коэффициент S (отношение высоты при площади пика к концентрации или массе компонента) является тангенсом угла наклона калибровочного графика. Тогда содержание вещества x (мкг) в пробе определяют из соотношения

x = hx/S

где hx – высота пика интересующего компонента, мм.

Метод нормировки – это метод калибровки по размерам пиков, широко применяемый в ГЖХ, в ВЭЖХ используют реже. Метод основан на измерении площади или высоты ка- ждого пика в хроматограмме и вычислении содержания каждого компонента, которое пропорционально площади или высоте. Содержание всех компонентов принимают рав- ным 100%. Метод нормировки применим в том случае, когда нужно определить процент- ное содержание всех компонентов смеси, что затруднительно при использовании метода абсолютной калибровки.

Метод внутреннего стандарта называют методом относительной или косвенной ка-

либровки. Метод основан на добавлении внутреннего стандарта – вещества с известной концентрацией, не присутствующего в первоначальной смеси, в неизвестный образец для получения отдельного пика на хроматограмме и компенсации различных аналитических ошибок. Внутренний стандарт должен быть химически инертным, полностью отделяться от других компонентов смеси, концентрация его должна быть близка к концентрации оп- ределяемых веществ.

Калибровку с использованием внутреннего стандарта проводят при хроматографиро- вании смесей, содержащих внутренний стандарт в постоянной концентрации, а интере- сующий компонент в разных концентрациях. Измерив площади или высоты определяе- мых соединений, строят график их отношений к площади или высоте внутреннего стан- дарта в зависимости от концентрации интересующего компонента. Внутренний стандарт должен вноситься в такой концентрации, чтобы отношение высот h или площадей S пиков стандартов и компонентов было равно 1.

К основным узлам жидкостного хроматографа относятся насос для подачи элюента, дозатор или пробоотборник, хроматографическая колонка, детектор и регистрирующее устройство (самописец или дисплей). Кроме того, жидкостные хроматографы имеют раз- личные вспомогательные блоки и системы, например, систему термостатирования и др. Система подачи элюента включает дополнительные узлы: блок дегазации, устройство для проведения градиентного элюирования, насосы, систему поддержания и измерения давле- ния. Насосы обеспечивают постоянную скорость потока элюента от 0,1 до 10 см3/мин при давлении ~ 4–40 МПа. Тщательное удаление газов из применяемых растворителей необ- ходимо для устранения пузырьков из магистралей перемещения жидкой фазы. Современ- ный жидкостной хроматограф имеет достаточно сложное устройство, обеспечивающее отбор элюентов из 2–3 емкостей в смеситель, затем в колонку, а также снабжен дозатора- ми, работающими при высоких давлениях.

Для ввода пробы исследуемой смеси применяются петлевые дозаторы или специаль- ные микрошприцы. Часто используют дозатор с остановкой потока.

Хроматографические колонки изготавливают из стекла или нержавеющей стали. Ко- лонки должны быть механически прочными и химически стойкими к действию элюента,

115

хроматографируемых компонентов и соединений, применяемых при пробоподготовке. Зерна твердого носителя должны иметь определенный гранулометрический состав и фор- му, близкую к сферической. Для приготовления элюентов и десорбентов применяются би- дистиллят и специально очищенные органические растворители. При перемещении элю- ента через слой неподвижной фазы вдоль колонки компоненты разделяемой смеси долж- ны фиксироваться детектором в виде четких неразмытых пиков.

В методе ВЭЖХ применяются стандартные прямые колонки длиной 10, 15 и 25 см с внутренним диаметром 4,0–5,5 мм. Объемы соединительных трубок, колонок, ячеек де- тектора, пробоотборника должны быть как можно меньшими, это устраняет размывание хроматографических пиков.

Детекторы служат для преобразования физического или физико-химического пара- метра в электрический сигнал, они регистрируют во времени содержание хроматографи- руемого компонента в подвижной фазе на выходе из колонки. Детекторы метода ЖХ под- разделяют на оптические (фотометрические, флуориметрические, хемолюминесцентные, рефрактометрические) и электрохимические (кондуктометрические, кулонометрические, амперометрические, полярографические). Наибольшее применение получили спектрофо- тометрические детекторы, работа которых основана на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой (190–380 нм) или видимой (380–800 нм) областях спектра. Такие детек- торы характеризуются высокой чувствительностью к органическим соединениям различ- ных классов, широким линейным динамическим диапазоном, малым рабочим объемом ячейки (<10–6 дм3), небольшим расширением пиков, высокой воспроизводимостью пока- заний. Они не разрушают определяемые соединения, малочувствительны к изменениям скорости потока подвижной фазы и температуры. В настоящее время получили широкое распространение высокоскоростные диодно-матричные спектрофотометрические детек- торы, регистрирующие спектр в течение 0,01–0,05 с. Современные жидкостные хромато- графы снабжены компьютерной системой обработки результатов измерений. В блоке па- мяти такой системы хранится информация о спектрах поглощения большого числа орга- нических веществ.

Работа электрохимических детекторов основана на электрохимических свойствах оп- ределяемых соединений, находящихся в потоке элюента. Различают детекторы, которые реагируют на изменение свойств элюента (кондуктометрические) или конкретный сорбат (амперометрические). Большинство электрохимических детекторов работает в амперо- метрическом режиме, при котором поддерживается постоянное напряжение между двумя электродами, погруженными в поток элюента, и сила тока регистрируется в зависимости от времени. Преимуществом таких детекторов являются простота конструкции, низкие пределы обнаружения, возможность регулирования селективности путем смены режимов работы детекторов, замены или модификации электродов.

Метод ВЭЖХ применяется для определения различных ЛВ и примесей в субстанциях и ЛФ, биологически активных соединений (например, витаминов). Подбор элюента и ис- пользование градиентного элюирования позволяет анализировать лекарственные смеси с близкими свойствами компонентов. На рис. 12 представлена хроматограмма смеси ком- понентов лекарственного препарата «Антигриппин», имеющего сложный состав.

3

S

1

	2	116
		4

560,75

457,95

355,15

252,35

149,55

46,75

0

2

4

6

8

Рис. 12. Хроматограмма компонентов лекарственного препарата «Антигриппин»: 1 – кислота аскорбиновая; 2 – 4-аминофенол; 3 – парацетамол; 4 – хлорфенамин малеат

Несмотря на известные технические проблемы, широкое практическое применение метода ВЭЖХ обусловлено такими достоинствами, как универсальность, возможность ав- томатизации разделения и анализа сложных смесей органических и неорганических ве- ществ, высокая эффективность и низкие пределы обнаружения компонентов, экспресс- ность. Метод адсорбционной ВЭЖХ, как и метод газовой хроматографии, предназначен для серийного разделения ЛВ органической природы различных классов.

117

7.1.2. Газовая хроматография

Газовая хроматография (ГХ) – метод разделения и определения летучих соединений. Компоненты анализируемой смеси распределяются между неподвижной фазой (твердое вещество или жидкость) и газом-носителем – подвижной фазой.

Жидкая неподвижная фаза применяется в газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и рас- пределяется в виде тонкой пленки на поверхности инертного твердого носителя. Большой выбор жидких фаз, позволяющий работать в широком температурном диапазоне (20– 400°С), делает ГЖХ наиболее селективным хроматографическим методом разделения. Низ- кие пределы обнаружения, экспрессность, точность и простота операций обеспечили мето- ду ГЖХ широкое применение для анализа сложных объектов.

В результате движения вдоль неподвижной фазы компоненты, находящиеся в парооб- разном состоянии, контактируют с адсорбентом или жидкостью. Происходит многократ- ный переход вещества из одной фазы в другую (цикл сорбция-десорбция). Этот процесс обусловлен физико-химическими свойствами подвижной и неподвижной фаз, а также ки- нетическими параметрами установления межфазного равновесия.

Разделение смеси происходит в колонке – главной составной части хроматографа. Обычно колонки заполняют твердым инертным носителем, на который в виде тонкой пленки наносят нелетучую жидкость. Колонки изготавливают из стали, стекла или по- лимерного материала, их скручивают в спираль в соответствии с размерами термостата хроматографа. Применяются также капиллярные колонки – трубки малого диаметра, на стенки которых наносят тонкую пленку жидкости или адсорбента.

Твердый носитель, характер и количество жидкой фазы, длина и температура колонки

– важные факторы, обусловливающие разделение смесей.

Твердый носитель предназначен для удерживания тонкой равномерной пленки жид- кой фазы. Требования к носителю:

–большая удельная поверхность (от 1 до 20 м2/г);

–малый и одинаковый диаметр пор;

–инертность (минимальные химические и адсорбционные взаимодействия с пробой);

–механическая прочность (носитель не должен измельчаться при заполнении и экс- плуатации колонки).

Содержание неподвижной жидкой фазы обычно составляет 5–15% от количества твердого носителя.

Выбор жидкой фазы в методе ГЖХ зависит от состава анализируемой смеси и осуще- ствляется с учетом следующих требований:

–хорошая растворяющая способность компонентов смеси (при малой растворимости компоненты выходят из колонки быстро, разделение неудовлетворительное);

–избирательное растворение компонентов смеси;

–малая летучесть и химическая инертность при заданной температуре колонки. Полнота информации о пробе (предполагаемые компоненты и их строение, диапазон

температур кипения) облегчает выбор неподвижной жидкой фазы колонки и условий хроматографирования.

Для достижения эффективного разделения жидкая фаза по химическому строению должна быть аналогом компонентов анализируемой смеси. Так, полярные соединения (например, спирты) лучше разделяются на полярной жидкой фазе. При этом компоненты одной и той же природы выходят из колонки в последовательности, соответствующей возрастанию их температур кипения.

Выбор газа-носителя обусловлен эффективностью колонки, чувствительностью и принципом действия детектора. Обычно в качестве газа-носителя применяют гелий и азот. Газ-носитель должен удовлетворять следующим требованиям:

–инертность, исключающая возможность взаимодействия с пробой или неподвижной фазой;

–обеспечение необходимых диффузионных характеристик, определяющих эффектив- ность колонки;

118

–отсутствие влияния на показания детектора;

–чистота;

–доступность.

Газ-носитель, как правило, поступает в колонку хроматографа из баллона со сжатым газом. При изотермическом хроматографировании сопротивление колонки не меняется во время анализа. Для поддержания постоянного давления на входе в колонку и, следова- тельно, для сохранения неизменной скорости газа-носителя применяется регулятор давле- ния. При данной температуре неизменная скорость газа-носителя обеспечивает постоян- ство времени удерживания анализируемых веществ. Оптимальную скорость газа-носителя обычно устанавливают экспериментально, она возрастает с увеличением длины и внут- реннего диаметра колонки.

Интенсивность разделения смеси зависит от температуры. Обычно повышение темпера- туры на 30°С вдвое увеличивает скорость перемещения компонентов смеси, результатом по- вышения температуры является сокращение продолжительности анализа.

Как правило, при снижении температуры достигается более полное разделение. Опти- мальная температура должна быть не очень высокой (при этом ухудшается разделение) и не слишком низкой (это способствует увеличению времени удерживания). Температуру устанавливают примерно на уровне, равном средней температуре кипения смеси.

При выборе температуры колонки учитываются также физико-химические свойства жидкой фазы (температуры кипения, плавления и деструкции). Хроматографирование при постоянной по всей длине колонки температуре представляет собой изотермический про- цесс.

В изотермическом режиме разделение сложных смесей затруднено. Особенно это от- носится к смесям гомологов, температуры кипения которых значительно различаются. Для улучшения разделения таких смесей изменяют температуру колонки во времени по определенной программе (газовая хроматография с программированием температуры).

С увеличением длины колонки разделение улучшается, однако при этом хроматогра- фические пики размываются. Длина насадочных колонок составляет от 1 до 4 м; длина капиллярных колонок достигает 15–20 м.

Количество вводимой в хроматограф пробы обусловлено производительностью и эф- фективностью колонки, а также чувствительностью детектора. Объем пробы не должен приводить к перегрузке колонки и ухудшать разделение смеси. Обычно объем вводимой пробы составляет 0,0005–0,1 см3.

Наибольшее распространение в ГЖХ получили детекторы дифференциального типа, их сигнал пропорционален концентрации или скорости потока определяемого компонен- та. Примером детектора, реагирующего на концентрацию, является детектор по теплопро- водности (катарометр). Действие такого детектора основано на том, что нагретое тело те- ряет тепло со скоростью, зависящей от состава окружающего газа. Ячейка детектора по теплопроводности представляет собой металлический блок с двумя каналами, через кото- рые протянута электрообогреваемая платиновая или вольфрамовая проволока. Сопротив- ление проволоки является функцией температуры, зависящей от теплопроводности газо- вой смеси. При сравнении теплопроводности двух проволок, находящихся в каналах, че- рез которые проходят соответственно чистый газ-носитель и его смесь с определяемым компонентом, получают величину, пропорциональную концентрации детектируемого ве- щества. Теплопроводность водорода или гелия значительно выше, чем теплопроводность большинства газов, поэтому такие измерительные ячейки характеризуются большой чув- ствительностью. Вследствие простоты и универсальности катарометры находят широкое применение, ограничение связано с невозможностью определения следовых количеств веществ.

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД) реагирует на массовую скорость потока определяемого компонента (потоковый детектор). Действие ПИД основано на том, что при горении чистого водорода почти не образуются ионы (слабый ионный ток). При вне- сении в пламя водорода органических соединений, содержащих СН-группу, сила ионного тока возрастает. Детектор состоит из сопла для подачи смеси газа-носителя, водорода и

119

воздуха, при горении которых образуется небольшое пламя. Над соплом расположен элек- трод-коллектор, вторым электродом является сопло. Возникающий ионный ток усиливают и измеряют. ПИД на два порядка превосходит по чувствительности катарометр и при- годен для определения следовых количеств веществ. Обслуживание и работа ПИД требу- ют больших производственных затрат, чем при использовании детектора по теплопровод- ности, поскольку необходимо применять усилитель и три вида газов (газ-носитель, во- дород и воздух), скорость которых регулируют одновременно.

Наряду с катарометрами и ПИД выпускаются детекторы других типов:

–детектор по измерению плотности газов;

–пламенно-фотометрический, основанный на измерении интенсивности излучения некоторых элементов пробы в пламени;

–электронозахватный (или детектор по постоянству рекомбинации), основанный на по- глощении определяемым веществом β-излучения радиоактивного никеля и некоторых дру- гих изотопов;

–фотоионизационный, основанный на измерении тока (определяемое соединение ио- низируется с помощью рентгеновских лучей).

Время удерживания служит основой идентификации, поскольку определяется свойст- вами системы сорбент – сорбат. Количественный анализ основан на измерении площадей пиков или их высот при условии симметричности пиков.

В качестве примера использования метода ГЖХ в фармацевтическом анализе можно привести определение летучих фенолов (фенол, крезолы, тимол и др.) – широко распро- страненных дезинфицирующих средств. Метод ГЖХ широко используется для идентифи- кации этилового спирта в различных ЛФ (настойки, экстракты и т.д.) и анализе этилового спирта. Газохроматографическим методом идентифицируют 18–20 компонентов (спирты, эфиры, альдегиды, кетоны) спиртовой фракции, полученной при обезвоживании продукта. Достоинством метода является возможность определения примеси воды в спиртсодержа- щих ЛФ. При нарушении технологических режимов ректификации содержание воды в спирте возрастает, одновременно повышается концентрация примесей летучих органи- ческих соединений. Увеличение содержания воды в спирте крайне нежелательно, по- скольку является нормируемым стандартом показателем качества готовой продукции. Га- зохроматографический анализ спирта-ректификата выполняют с применением детектора по теплопроводности, содержание воды в спирте находят методом абсолютной гра- дуировки. Предварительная пробоподготовка при этом не требуется.

7.1.3. Планарная хроматография

Планарная хроматография – способ хроматографического анализа, в котором процес- сы разделения смеси веществ осуществляются в плоском слое сорбента (неподвижной фа- зе). Планарная хроматография подразделяется на бумажную и тонкослойную. В первой в качестве сорбента используется специальная бумага. Во второй процессы разделения про- исходят в тонких слоях сорбента, нанесенного на инертную твердую подложку, или в пленках пористого полимерного материала. Бумажная и тонкослойная хроматографии сходны по технике выполнения анализа.

Хроматография в тонком слое (ТСХ) – один из простейших методов хроматографиче- ского анализа, разделение компонентов происходит при перемещении подвижной фазы через нанесенный на подложку (пластинку) тонкий слой сорбента. Продвижение элюента (подвижная фаза) через сорбент (неподвижная фаза) обеспечивается капиллярными сила- ми. Метод ТСХ сочетает преимущества хроматографии на бумаге и колоночной хромато- графии, а именно легкость обнаружения отдельных компонентов при опрыскивании пла- стинок различными реактивами и широкий выбор адсорбентов, применяемых в колоноч- ной хроматографии. Разделение происходит быстро, как правило, в течение 30 мин. Метод позволяет достаточно легко подбирать элюент и сорбент для решения конкретной анали- тической задачи. В качестве проявляющих реактивов применяются более агрессивные жидкости и растворы, чем в хроматографии на бумаге. ТСХ относится к мик-

120