Лабораторна робота № 5

Тема: Будова бактеріальної клітини. Диференційні методи забарвлення

Мета: вивчити будову прокаріотичних організмів, оволодіти складним методом забарвлення за Грамом та деякими методами диференційного забарвлення внутрішньоклітинних структур і включень мікроорганізмів

Матеріали й устаткування: культури мікроорганізмів, що вирощені на агаризованому середовищу (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Saccharomyces cereviceae та ін.), мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з барвниками, 96-ний спирт, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Барвники для забарвлення за Грамом:

1. Феноловий розчин генціанфіолетового: генціанфіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

2. Розчин Люголя: йодид калію –2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл. Спочатку готують концентрований розчин йодиду калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера: 1 мл карболового фуксину Циля і 9 мл дистильованої води.

Теоретичні положення

Мікробна клітина – складна жива система, що характеризується високим ступенем упорядкованості складових її структур; кожна структура має визначену життєву функцію і їхня взаємодія між собою забезпечує існування клітини, її цілісність.

Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні методи забарвлення – цитохімічні методи дослідження. Багато з цих методів переслідують діагностичні цілі. За формою клітини мікроорганізми не занадто різноманітні, та в ряді випадків, щоб установити приналежність мікроба до того чи іншого роду й виду, необхідно провести спеціальне забарвлення клітини чи речовини, що накопичується в ній.

Порядок виконання роботи

1. Вивчити ультраструктуру бактеріальної клітини. Розглянути мікрофотографії мікроорганізмів, що одержані за допомогою електронного мікроскопа. Замалювати схематичну будову узагальненої бактеріальної клітини (додаток 1).

2. Забарвити бактерії за Грамом. Забарвлення за Грамом є найбільш універсальним із диференціальних методів фарбування мікробних кліток. Він заснований на розходженні в хімічному складі клітинних оболонок і має важливе діагностичне значення у визначенні видів бактерій. Усі бактерії щодо цього методу фарбування поділяються на грампозитивні й грамнегативні.

Сутність фарбування полягає в тім, що грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. У грамнегативних мікроорганізмів це сполучення з'являється тимчасово і знебарвлюється після обробки спиртом. У наступному фарбуванні фуксином вони здобувають рожево-червоний колір. Здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від віку культури: у старій культурі мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Деякі бактерії (коринебактерії, протей) офарблюються грамваріабельно. Фарбувати за Грамом необхідно клітини молодих (частіше однодобових) культур. Доцільно також офарблювати клітини контрольних мікроорганізмів, відношення яких до забарвлення за Грамом заздалегідь відомо. Мазок для фарбування за Грамом повинний бути тонким, щоб клітини рівномірно розподілялися на поверхні скла і не утворювали скупчень.

Техніка фарбування за Грамом. На добре знежиреному предметному склі готують три тонких мазки різних культур мікроорганізмів: у центрі наносять мазок досліджуваного мікроорганізму (чи суміші грамнегативних і грампозитивних бактерій), по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними (наприклад, Staphylococcus aureus), іншої – грамнегативними (наприклад, Escherichia coli).

Мазки висушують у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. Фіксація хімічними сполуками не рекомендується.

На фіксований мазок наливають розчин карболового генціанового чи кристалічного фіолетового. Мазки офарблюють протягом 1 хвилини.

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, обробляють його розчином Люголя протягом 1 хвилини до повного почорніння.

Зливають розчин Люголя і препарат, не промиваючи водою, обробляють із безперервним погойдуванням 96 %-ним етиловим спиртом протягом 15–20 с. Час знебарвлення дуже істотний, за умов переривання зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини, якщо термін обробки надлишковий терміну препарат виявиться перефарбованим.

Промивши препарат водою, його додатково офарблюють протягом 1 хвилини водним фуксином Пфейфера. Барвник зливають, препарат знову промивають водою, висушують і проводять мікроскопію з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії за умов правильного фарбування набувають синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – червоно-рожевий колір фуксину.

3. Виявити капсули за допомогою спеціальних негативних методів фарбування.

Деякі види бактерій утворюють слизисті капсули з полісахаридів, іноді поліпептидів і води. Звичайні методи забарвлення залишають їх безбарвними. Для виявлення бактерій застосовують спеціальні негативні методи фарбування.

3.1. Виявлення капсул у негативному рідкому прижиттєвому препараті. На добре знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять велику краплю чорної туші й у неї – краплю досліджуваної культури мікроорганізмів. Суміш ретельно перемішують і накривають покривним склом. Покривне скло обережно притискають до предметного смужкою фільтрувального паперу. Виконують мікроскопію препарату, користаючись об'єктивом 40х. На темному фоні туші виявляються прозорі зони капсул навколо різко обкреслених клітин.

3.2. Негативний метод Буррі. Краплю туші (1:9) поміщають на добре знежирене предметне скло і змішують із краплею рідини, що містить бактерії. За допомогою покривного скла розподіляють мазок тонким шаром на поверхні предметного скла. Після того як препарат висохне у повітрі, виконують його мікроскопію, користаючись об'єктивом МІ-90. У полі зору мікроскопа на загальному темно-димчастому тлі чітко видні незабарвлені капсули й клітини мікроорганізмів.

4. Виявити ендоспори у бактерій.

Спори бактерій у порівнянні з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішнього середовища. Вони являють собою округлі, овальні чи еліпсоїдальні утворення. Якщо діаметр спори не перевищує діаметра клітини, у якій утворилася спора, клітина називається бацилярною, якщо перевищує, то в залежності від розташування спори – у центрі чи на кінці клітини – клостридіальною чи плектридіальною. У бацилярній клітині спора може розміщатися центрально, термінально або ексцентрально. Спори бактерій можна розрізнити по більш сильному заломленню світлових променів.

Більш надійний метод виявлення спор полягає в диференційному забарвленні клітин та спор, що заснований на різній здібності забарвлюватися барвниками та утримувати його під час обробки водою чи кислотою. Виявлення здатності культури до спороутворення краще проводити в старих культурах. Спори кислотостійкі, тому важко забарвлюються барвниками. Пояснюється це великою щільністю оболонки, низькою концентрацією води і високим умістом ліпідів. У препаратах, що пофарбовані простими способами чи за Грамом спори залишаються безбарвними. Усі наявні способи фарбування спор засновані на тому, що спочатку сильним барвником із прогріванням фарбують одночасно й клітину й спору. Потім протоплазму клітини знебарвлюють, залишаючи спори забарвленими. Після цього протоплазму фарбують додатково в інший, найчастіше, контрастний колір.

4.1. Спосіб Пєшкова. На знежиреному предметному склі готують тонкий мазок бактерій, висушують його у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. На фіксований мазок наливають розчин метиленового синього (за Льоффлером) і доводять його до кипіння, тримаючи препарат над полум'ям пальника. Кип'ятять протягом 15–20 сек. По мірі випаровування розчину метиленового синього додають нові порції барвника. Препарат ретельно промивають водою, після чого клітини дофарбовують 0,5 %-ним водним розчином нейтрального червоного протягом 30 сек. Барвник зливають, препарат знову промивають дистильованою водою, висушують і розглядають з імерсійною системою. За умови правильного дотримання всіх стадій обробки й фарбування препарату клітини здобувають червоний колір, а спори синій.

У випадку виявлення в мікроорганізмів здатності до спороутворення необхідно відзначити його тип (бацилярний, клостридіальний чи плектридіальний), розташування спори в клітині, форму вільних спор.

5. Визначити внутрішньоплазматичні включення бактерій.

Волютин – поліфосфат, запасна фосфор- і азотовмісна речовина, похідна нуклеїнової кислоти. Характерна його властивість – спорідненість до основних барвників і метахромазія, тобто здатність здобувати інший колір, ніж колір речовини, що забарвлює. Метод заснований на низькій розчинності волютину в кислотах.

Забарвлення волютина (метахроматичних гранул) за методом Омелянського. На знежирене скло наносять тонкий мазок суспензії мікроорганізмів (наприклад, дріжджів), сушать у повітрі, фіксують над полум'ям і забарвлюють карболовим фуксином Циля. Через 0,5–1 хвилину промивають препарат водою, знебарвлюють 20–30 с 1%-ним розчином H₂SО₄, промивають, додатково 20–30 с забарвлюють метиленовим синім (1:40), промивають, промокають, наносять олію і дивляться з імерсійною системою. Гранули волютину забарвлюються в червоний колір на фоні синьої цитоплазми.

Можна забарвити фіксовані препарати 10–30 с метиленовим синім Льоффлера, потім промити препарат водою, промокнути фільтрувальним папером і розглянути з імерсією. Гранули волютину мають фіолетовий колір на фоні блакитної цитоплазми.

Глікоген – вуглевод, тваринний крохмаль. Часто він накопичується в клітинах дріжджів, бацил і забарвлюється розчином Люголя в коричневий колір. Для збагачення дріжджових кліток глікогеном їх вирощують на солодовому середовищі. Включення глікогену добре дослідити в 1–2 добових культурах Saccharomyces cereviceae і Bacillus micoides.

Забарвлення глікогену. На чисте предметне скло наносять невелику краплю суспензії мікроорганізму і до неї додають таку ж краплю розчину йоду в йодиді калію. Зверху поміщають покривне скло, надлишок рідини видаляють фільтрувальним папером. Препарат переглядають із використанням об'єктива 40х, забарвлений фіксований мазок без покривного скла – з імерсією.

Гранульоза – вуглевод, крохмалоподібна речовина. У великій кількості накопичується в клітинах маслянокислих бактерій – Clostridium butyricum перед спороутворенням. У якості об'єкта варто скористатися накопичувальною культурою маслянокислих бактерій. Її одержують таким способом: за 3–4 доби до занять у пробірки поміщають дрібно нарізана неочищена картопля (1/3 пробірки), на кінчику ножа вносять крейду і доливають доверху водопровідною водою. Пробірку поміщають у водяну баню і нагрівають 10 хвилин із дотриманням температури 70С , потім прохолоджують і ставлять у термостат при 30 С. Для готування препарату маслянокислих бактерій беруть піпеткою краплю суспензії з придонного шару.

Забарвлення гранульози. У невелику краплю суспензії маслянокислих бактерій додають таку ж краплю розчину Люголя, закривають покривним склом, видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером і переглядають із використанням об'єктива 40х, забарвлений фіксований мазок без покривного скла – з імерсією.

Жир міститься в клітинах практично усіх видів мікроорганізмів, особливо багато його накопичується у старій культурі. У світловому мікроскопі крапельки жиру можна виявити за більш сильним заломленням світла, ніж навколишня цитоплазма. Однак частіше для виявлення жироподібних речовин використовують ліпофільні барвники (наприклад, судан III).

Об'єкти для дослідження – старі культури дріжджів, Bacillus micoides, Bacillus megaterium.

Простий метод виявлення ліпідних гранул суданом III. На предметне скло нанести краплю дріжджової суспензії і змішати її з краплею розчину судану III. Накрити покривним склом і виконати мікроскопію з об'єктивом 40х. У полі зору мікроскопа видно рожево-червоні краплі ліпідів у безбарвній цитоплазмі.

6. Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків, вказати назву об’єктів, відзначити при цьому морфологічні особливості мікроорганізмів, наявність капсул, спор, включень.

7. Після закінчення роботи предметні й покривні стекла з препаратами перш, ніж вимити, продезінфікувати.