Лабораторна робота № 13

Тема: Загальний мікробіологічний аналіз ґрунту

Мета: визначити кількість мікроорганізмів у пробах досліджуваного ґрунту, провести спостереження за зміною мікробних пейзажів

Матеріали й устаткування: наважка ґрунту 10 г, 2 колби з 100 мл стерильної води, чашки Петрі з стерильними МПА (на двох студентів), 2 стерильні піпетки на 1 мл, скляні та залізні шпателі, пінцети, спиртівки, поживні середовища КАА, Чапека, Ешбі, Виноградського, ґрунтова витяжка по Фішеру, середовище Гетчинсона, добрива, мікроскопи, імерсійна олія, фільтрувальний папір, предметні скельця, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, дистильована вода, барвники за Грамом

Теоретичні положення

Ґрунт є середовищем для існування більшості мікроорганізмів. У ньому живуть бактерії родів Pseudomonas, Bacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Bacillus, Clostridium, різні види грибів, водоростей, найпростіших.

Для визначення чисельності представників еколого-трофічних груп ґрунтової мікрофлори користуються методами:

1) прямого підрахунку клітин під мікроскопом (метод Виноградського). Метод Виноградського дає достовірні, але завищені дані, бо ним неможливо розрізнити живі і мертві клітини мікроорганізмів;

2) культивування мікроорганізмів на поживних середовищах. Для визначення кількості життєздатних клітин у ґрунті користуються методами висіву ґрунтової суспензії на тверді та рідкі поживні середовища. Ці методи дають занижені дані, бо виростають не всі мікроорганізми ґрунту, а лише ті, які здатні до росту на вибраних для досліду середовищах. Методами культивування визначається лише десята частина від кількості мікроорганізмів, що виявляється методом прямого мікроскопування. Запропоновано багато способів посіву і велику кількість поживних середовищ. Найчастіше використовують метод висіву мікроорганізмів з водної суспензії на тверді середовища в чашках Петрі або на рідкі середовища в пробірках;

3) вивчення мікробних пейзажів ґрунту (метод «скелець обростання» М.Г. Холодного, капілярний метод Б.В. Перфільєва і Д.Р. Габе). Ці методи дозволяють дослідити груповий склад мікроорганізмів ґрунту.

Порядок виконання роботи

Робота складається з кількох етапів.

1. Взяття середньої ґрунтової проби і підготовка зразку.

Середню ґрунтову пробу одержують, змішуючи окремі зразки, кількість яких залежить від мікрорельєфу (рівний, хвилястий, схил) та площі. Рекомендують з площі 100 м² брати пробу з трьох точок, з більше ніж 100 м² – з п’яти точок, з 1 га – більше 15 точок. При дослідженні пашні проби беруть з глибини всього орного шару, знімаючи верхній 2-сантиметровий шар, при дослідженні мікрофлори ґрунтового профілю – по генетичним горизонтам (знизу вверх).

Ґрунтовий зразок беруть стерильним буром, стерильною лопатою і стерильним ножем в заздалегідь підготовлену скляну широкогорлу банку, яка закривається корковою пробкою, обгорнутою стерильною ватою, в стерильні поліетиленові або пергаментні мішки. На пакети, банки наклеюють етикетки із зазначенням місця взяття проби, горизонту та інших даних.

Бур, лопату, ніж в полі перед взяттям зразку ретельно очищують, потім обпалюють спиртом.

Ґрунтові зразки аналізують в першу добу. При необхідності допускається зберігання їх в холодильному приміщенні (холодильнику) протягом двох днів. Для більшої однорідності середнього зразку, дотримуючись усіх правил асептики, його ретельно перемішують, виймаючи корені рослин, різні включення.

2. Приготування ґрунтової суспензії та посів.

На стерильному часовому склі стерильним шпателем (або амонієвою ложкою) розмішують 10 г ґрунту. Щоб при зважуванні в ґрунт не потрапили бактерії з повітря, часове скло накривають іншим часовим склом. (Шпателі, ложки, скельця стерилізують фламбуванням). Наважку ґрунту переносять в колбу на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води, збовтують 10 хвилин на механічній гойдалці і дають відстоятися грубим часткам ґрунту.

Одночасно зі взяттям наважки для аналізу з середньої проби відбирають 10–20 г ґрунту для визначення вологості, оскільки одержані при аналізі дані перераховують на 1 г абсолютно сухого ґрунту.

Встановлено, що більше мікроорганізмів виявляється, якщо наважку заздалегідь помістити в стерильну фарфорову чашку або ступку, зволожити (0,4–0,8 мл води або 0,1 % розчином пірофосфату Na₄P₂O₇ на 1 г ґрунту) і 5 хвилин розтирати стерильним резиновим пестиком або пальцем в стерильній резиновій рукавиці до пастоподібного стану.

Перед приготуванням суспензії для кожного зразку готують дві стерильні колби на 250 мл, одна містить 100 мл стерильної водопровідної води, друга – пуста. Водою з першої колби розтерту ґрунтову масу змивають в пусту стерильну колбу. Колбу з суспензією струшують 5 хвилин, залишають на 30 с і готують розведення, які містять різні концентрації ґрунту. 1 мл суспензії в першій колбі відповідає розведенню 10^-1. Послідуючі розведення (10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 і т.д.) краще робити в колбах на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води.

З кожного попереднього розведення окремою стерильною піпеткою беруть 10 мл суспензії і переносять в наступну колбу з 90 мл Н₂О. Кожний раз піпетку споліскують і залишають. Наступні колби струшують по 1 хвилині. З одержаних розведень проводять висіви на щільні та рідкі середовища. Набір середовищ залежить від задач бактеріологічного аналізу ґрунту.

Після певного часу інкубації при 20–30°С культури мікроорганізмів аналізують.

3. Провести спостереження за зміною мікробних пейзажів під впливом добрив.

У три банки вміщують наважки ґрунту по 200 г кожна і проводять дослід за схемою:

1 банка – контроль (ґрунт);

2 банка – органічні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав);

3 банка – органічні та мінеральні добрива (ґрунт + 2 г розмеленого сіна бобових трав + 100 мг аміачної селітри).

У кожну банку закопують вертикально по 2 скельця на відстані 5 см між ними і витримують банки при температурі 25–28°С, періодично зволожуючи ґрунт. Через два тижні викопують одне скельце, через місяць – друге. Їх поверхню розглядають під мікроскопом, мікробні пейзажі замальовують в зошит.