Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з правилами поведінки й техніки безпеки в мікробіологічній лабораторії.

2. Ознайомитися з будовою світлопольного мікроскопу (монокуляри, бінокуляри), які використовуються при виконанні лабораторних робіт з дисципліни.

3. Вивчити основні види мікроскопії, які застосовуються для дослідження живих клітин мікроорганізмів, а також встановити їх переваги та недоліки.

4. Визначити можливі варіанти загального збільшення світлопольного мікроскопу та його дозвільної здатності.

5. Замалювати малюнки згідно методичним вказівкам, зробити необхідні обчислення та висновки.

Лабораторна робота №2

Тема: Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів різних систематичних груп. Прості методи забарвлення

Мета: освоїти методики приготування препаратів живих і фіксованих забарвлених мікроорганізмів та техніку мікроскопії

Матеріали й устаткування: постійні препарати культур мікроорганізмів різних систематичних груп (Streptococcus lactis, Micrococcus lisodeikticus, Lactobacillus acidophylum, Streptomyces recifensis, Staphylococcus aureus, Lactobacterium plantarum, Bacillus subtilis та ін.), природні субстрати, мікроскопи, предметні і покривні скельця, крапельниці з водою, бактеріологічні петлі, препарувальні голки, імерсійна олія, метиленовий синій, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, бензин, серветки, фільтрувальний папір, промивалка з дистильованої водою, розчин, що дезінфікує

Теоретичні положення

Мікроскопічні дослідження мікроорганізмів проводять в живому або фіксованому стані. Мікроскопія мікробних клітин в живому стані застосовується головним чином для вивчення їх розмірів, форми, структури, рухомості, характеру розмноження, відношення клітин до різних хімічних подразників. З цією метою найчастіше готують препарати роздавлена та висяча краплі.

Метод «роздавленої краплі». На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії мікроорганізмів. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою.

Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між скельцями не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлювання» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.

Метод «висячої краплі». Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості мікроорганізмів. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю мікроорганізмів: розмноженням, утворенням і проростанням спор.

Для готування препарату невелику краплю суспензії мікроорганізмів наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненою у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об'єктом.

Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр полю зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у темнопольній або фазово-контрастній мікроскопії.

Препарат «відбиток». Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування клітин у колонії мікроорганізмів й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.

З агаризованої пластинки, на якій мікроорганізми виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з мікроорганізмами була обернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися ним поверхні колонії. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.

Дослідження фіксованих забарвлених препаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку мікроорганізмів, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсійною системою. Їхнє готування включає наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.

У простому забарвленні мікроорганізмів застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.

Готування мазка. За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізму. Матеріал із густого живильного середовища узяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1–2 см².

Висушування мазка. Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум'ям пальника мазком нагору. Цю операцію проводять дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.

Фіксація дає можливість швидко перервати протікання життєвих процесів у живому об’єкті, зберігаючи його тонку структуру. Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення клітин до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами.

Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації – термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум'я пальника. Щоб уникнути перегріву, час прямого впливу полум'я не повинний перевищувати 3–4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96 %-ний етиловий спирт (час фіксації 5–10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт : ефір – 1 : 1; час фіксації 10–15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.

Забарвлення. Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2–3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2–3 хвилини. Під час фарбування розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером.

Існують прості і диференційовані методи забарвлення. При простому забарвленні використовують один який-небудь барвник, наприклад метиленовий синій, фуксин, генціанфіолетовий в лужних або карболових розчинах. При цьому фарбується вся клітина. При диференційованому забарвленні різними барвниками забарвлюються тільки окремі структури клітини. Наприклад – метод забарвлення за Грамом, забарвлення спор, джгутиків, нуклеоїду та ін.

Барвники за хімічною природою розподіляються на кислі та лужні. Їх також поділяють на позитивні й негативні. З барвників, які застосовуються в мікробіологічній практиці, більшість відноситься до позитивних. Вони забарвлюють всю клітину при кімнатній температурі протягом 30–60 с. Негативні барвники забарвлюють проміжки, які оточують клітини мікроорганізмів. В результаті клітини виглядають силуетами на фоні барвника.

Правила роботи з імерсійним об'єктивом. Після установлення освітлення приготовлений сухий пофарбований препарат спочатку розглядають із невеликим збільшенням під об'єктивом сухої системи (8х, 40х). Знайшовши найбільш удале місце на ньому, препарат закріплюють затисками на столику мікроскопа. Тубус мікроскопа піднімають і, повертаючи револьвер, установлюють імерсійний об'єктив. Потім у центр препарату на мазок, не знімаючи зі столика мікроскопа, наносять краплю імерсійної (кедрової) олії і, дивлячись збоку, обережно опускають тубус мікроскопа до занурення об'єктива в олію. Стежать за тим, щоб фронтальна лінза не торкнулася предметного скла і не одержала ушкодження. Після цього, дивлячись в окуляр, макрометричним гвинтом повільно піднімають об'єктив до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Фокус уточнюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об'єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об'єктивів.

У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.