Виділення чистих культур за методом Коха

Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:

• розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3–4 стерильні чашки Петрі;

• мікроорганізми висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 7.1) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем;

• спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури й обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні;

• потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі;

• після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму;

• інкубують посіви звичайно протягом 2–5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів);

• після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії мікроорганізмів, що представляють потомство однієї клітини;

• ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище;

Висів із накопичувальної культури мікроорганізмів, що відносяться до факультативних аеробів чи факультативних анаеробів, для одержання ізольованих колоній роблять методом глибинного посіву в пробірки зі стовпчиком стерильного агару. Стерильною голкою беруть чисту культуру з колоній, одночасно виймають пробку, обпалюють край пробірки і, тримаючи її нагору дном, голкою над пальником роблять прокол до дна.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій за методом Коха можливо тільки в умовах, що виключають доступ до них вільного кисню. Анаеробні мікроорганізми можна культивувати у звичайних пробірках і чашках Петрі, поміщаючи їх після посіву в анаеростати – вакуумні скляні ексикатори.

Рис. 7.1. Розсів мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:

а – шпатель Дригальського;

б – розсів;

в – ріст мікроорганізмів після розсіву шпателем;

г – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з технікою поверхневого способу посіву на щільні середовища в чашки Петрі:

• на тверде середовище наносять петлею краплю посівного матеріалу і потім рівномірно розподіляють його на поверхні, користаючись стерильним шпателем Дригальського. За умови узяття рідини петлею вона повинна затягти петлю тонкою плівкою. Піпеткою користаються в тому випадку, коли матеріал засівають у великій кількості чи визначеному об’ємі;

• шпатель виймають із папера і беруть у праву руку;

• відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою і вносять у неї шпатель;

• розмазують краплю посівного матеріалу шпателем обертальними рухами на поверхні агарової пластинки (надавлювати шпателем на тверде середовище не треба, тому що можна йому зашкодити);

• з метою економії середовищ і посуду можна користатися однією чашкою, розділивши її на сектори і послідовно засівати їх штрихом (метод виснаженого штриха). Для цього спочатку засівають поверхню першого сектора, а потім послідовно засівають всі інші сектори клітинами, що залишилися на петлі. З кожним наступним штрихом відбувається зменшення кількості клітин, що засіваються;

• переносять шпатель у судину з дезінфікуючим розчином.

2. Ознайомитися з технікою глибинного посіву на тверді середовища в чашки Петрі:

• відкривають стерильну чашку і поміщають петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу на дно чашки;

• розплавляють агаризоване живильне середовище у пробірці чи колбі й охолоджують його до 45–50С;

• обпалюють край пробірки чи колби в полум'ї пальника і виливають середовище (15–20 мл) у чашку Петрі з внесеним посівним матеріалом, дотримуючись правил стерильної роботи;

• розподіляють рівномірно посівний матеріал у живильному середовищі, для чого обережно круговими рухами переміщають чашку Петрі на поверхні столу;

• залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища;

• роблять на чашці напис (число, назва мікроорганізму);

• усі посіви для вирощування мікроорганізмів поміщають у термостат із температурою, що сприятлива для їхнього росту.

3. Ознайомитися з технікою пересівання культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

• клітини мікроорганізмів, що виросли в рідкому живильному середовищі відбирають частіше стерильною піпеткою;

• зі стерильного папера виймають градуйовану стерильну піпетку за верхній кінець, беруть піпетку середнім і великим пальцями правої руки, не торкаючись поверхні тієї частини піпетки, що буде вводитися в судину з рідким середовищем;

• беруть у ліву руку пробірку (чи колбу) із культурою мікроорганізму, що вирощена в рідкому середовищі, і тримають її у вертикальному положенні, щоб не замочити пробку;

• відкривають пробку, дотримуючись правил асептики, і вводять піпетку в пробірку;

• набирають у піпетку суспензію мікроорганізму, закривають пробкою пробірку (чи колбу), вносять визначену кількість суспензії у свіже стерильне живильне середовище, дотримуючись правил стерильності;

• після використання піпетку поміщають у судину з дезінфікуючим розчином, не торкаючись нею навколишніх предметів (0,5 %-ний водний розчин хлораміну чи 3–5 %-ний водний розчин фенолу).

4. Ознайомитися з технікою посіву мікроорганізмів, що вирощені на твердому середовищі в пробірках, в іншу пробірку із середовищем:

• запалюють пальник. Посіви проводять над полум'ям пальника, щоб гаряче повітря перешкоджало осадженню мікроорганізмів з навколишнього повітря;

• беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець). Стерилізують бактеріологічну петлю в полум'ї пальника, прожарюючи дріт до червоності, і одночасно обпалюють частину утримувача, що примикає до петлі і буде вводитися в пробірку з культурою мікроорганізму. Упродовж прожарювання петлю тримають у полум'ї майже вертикально, щоб весь дріт був розпечений;

• беруть у ліву руку дві пробірки – одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – із культурою мікроорганізму;

• не випускаючи бактеріологічної петлі, мізинцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватяних пробок до долоні і виймають пробки з пробірок. Класти пробки на стіл не можна;

• злегка обпалюють у полум'ї пальника край відкритих пробірок;

• прожарену бактеріологічну петлю вводять у пробірку з культурою мікроорганізму. Щоб не зашкодити клітинам, петлю спочатку прохолоджують, доторкаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до живильного середовища, вільного від клітин мікроорганізмів, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси;

• виймають петлю і вводять її у пробірку зі стерильним живильним середовищем, уникаючи дотику зі стінками пробірки;

• проводять петлею від дна догори зигзагоподібний чи прямий штрих, злегка торкаючись поверхні агару;

• обпалюють ватяні пробки і край пробірок одночасно в полум'ї і закривають обидві пробірки;

• закриту ватною пробкою пробірку з культурою ставлять у штатив, а витягнутий матеріал використовують для готування препарату чи для пересівання культури у свіже середовище;

• обпалюють петлю в полум'ї;

• усі описані маніпуляції варто проводити біля полум'я, за можливістю швидко, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

5. Зобразити необхідні малюнки для кращого засвоєння матеріалу та зробити висновки.