Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

Друга група - спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.

Третя група - елективні середовища. їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів. Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відріз­ няють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера - для збудників дифтерії, середовище Плоскирева - для дизентерійних паличок, середовище Мюллера - для тифопаратифозних бактерій. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на середовищах, у складі яких є до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон.

Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група - диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих

властивостей тощо.		На поверхні щільного живильного середовища
		мікроорганізми можуть утворювати суцільний,
		густий ріст або ізольовані колонії. Колонія -
		це видимі неозброєним оком скупчення бактерій
		на поверхні або в товщі живильного середовища.
		Як правило, кожна колонія формується з нащад­
		ків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад
		досить однорідний. Утворення її є проявом куль-
		туральних властивостей бактерій.
		Характеристика колоній - важлива складова
		частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже
		мікроорганізмам кожного виду притаманні свої
		особливі колонії (рис. 20).
		Характеризувати колонії можна за різними
_ пп	„	ознаками. За величиною (діаметром)		вони поді-
Рис. 20.	Види колоній	'	г '
мікроорганізмів		ляються на великі (4-6 мм	і більше), середні

80

(2-4 мм), дрібні (1- 2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, непра­ вильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що про­ пускаю ть світло, і мутними.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяю ться на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусо­ подібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладень­ кою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth - гладенький), а шорсткі - R-форми (rough - шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіаль­ ну посмугованість тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, нитко­ подібні і волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистен­ цію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середови­ ще над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або жовту­ ватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

81

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

Морфологія й фізіологія вірусів

Віруси - особливий клас неклітинних форм життя, які вивчає самостійна галузь мікробіологічної науки - вірусологія. Відомо понад 2000 видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Віруси - убіквітарні істоти. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів були зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механіз­ мів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів та бактеріофагів увінчалось грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають нам ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Вірусні хвороби людей, тварин, рослин - справжнє лихо людства. Відомо понад 500 вірусів, які викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, натуральна віспа, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД - ось тільки деякі захворювання, з якими людина повинна вести постійну боротьбу.

Слово “вірус” означає “отрута”. Честь відкриття вірусів належить Д.Й. Івановському, який у 1892 р. описав вірус мозаїчної хвороби тютюну. У 1897 р. Леффлер і Фрош відкрили вірус ящура, а в 1917 р. Ф. д’Ерелль - бактеріофаги. Сьогодні віруси розглядають як неклітинні

системи живих істот, які відрізняються своїми малими розмірами, відсутністю у віріоні білоксинтезуючих та енергієгенеруючих сис­ тем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

Структура вірусів. Окрема вірусна частка одержала назву віріон. Він складається з однієї молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та білкового футляра, що її оточує, - капсида (сарБа -

82

вмістилище). Разом вони формують

нуклеокапсид (рис. 21).

Капсиди утворюються з білкових
субодиниць (поліпептидів), які назива­
ються капсомерами. їх кількість ста­
більна для кожного виду вірусів і ви­
користовується як таксономічна ознака.
В ір у с и з т а к и м т и п о м б у д о в и н а з и в а ­
ю т ь п р о с т и м и . До н и х н а л е ж а т ь н а й -
дрібніші з патогенних вірусів людини	Рис 21	Схематична будова віріо_
П О Л ІО ВІруси, а т а к о ж а д е н о в і р у с и ,	на: а - нуклгінова кислота; б - кап-
п а п о в а в ір у с и .	сиЗ; в -	суперкапсид; г - шипики

Проте більшість вірусів має ще одну оболонку - суперкапсидну, яка містить ліпіди. Вона пронизана вірусспецифічними білками - глікопротеїдами, які на поверхні оболонки утворюють особливі стуктури, що називаються шипами. Такі віруси називають складними або оболонковими. Структурною одиницею суперкапсидної оболонки є пепломер (рерІоБ - накидка). До них належать віруси віспи, герпесу, гепатиту В, грипу, енцефалітів, імунодефіциту людини та ін.

Віріони характеризуються поняттям симетрії. Тип симетрії зале­ жить від способу укладки нуклеїнової кислоти і, відповідно, розта­ шування капсомерів навколо неї. Виділяють ізометричний (або кубіч­ ний), спіральний та змішаний типи симетрії. Кубічний тип характе­ ризується тим, що капсомери утворюють багатогранник (найчастіше ікосаедр - 20-гранник), симетричний у трьох взаємоперпендикулярних площинах (вісях симетрії). Усі відомі ДНК-місткі віруси мають ізометричні (складні) капсиди (аденовіруси, герпесвіруси, віруси натуральної віспи), а також віруси, що містять РНК - пікорнавіруси, тогавіруси.

У віріоні зі спіральною симетрією молекула нуклеїнової кислоти закручена разом із капсомерами в тугу спіраль. Такий тип симетрії мають віруси мозаїчної хвороби тютюну, віруси грипу, кору епіде­ мічного паротиту та ін.).

Комбінований тип симетрії спостерігається у деяких вірусів - збудників лейкозу, саркоми, бактеріофагів. При цьому нуклеокапсид має кубічний тип симетрії, а нуклеопротеїд, розміщений у ньому, укладається спірально.

Форма вірусів може бути найрізноманітнішою: паличкоподібна (віруси сказу), сферична (віруси грипу, папіломи), кубоїдальна

83

(віруси натуральної віспи), головчаста або сперматозоїдна (деякі бактеріофаги), ниткоподібна (віруси грипу, віруси бактерій).

Розміри вірусів значно поступаються бактеріям, коливаючись у межах 20-400 нм. Визначити їх можна за допомогою електронного мікроскопа, ультрацентрифугування, а також при фільтруванні через спеціальні фільтри.

Класифікація вірусів. В основі сучасної класифікації вірусів ле­ жать ознаки, що характеризують тип нуклеїнової кислоти, їх морфо­ логію, особливості репродукції, антигенні властивості тощо. За наяв­ ністю нуклеїнової кислоти їх поділяють на ДНК-місткі та РНК-міст- кі (або ДНК-геномні та РНК-геномні) віруси. Всередині цих груп розрізняють родини, підродини, роди та види. До ДНК-містких вірусів належать 7 родин: Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Iridoviridae. РНК-місткі віруси формують 13 родин: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Arenaviridae, Coron a- viridae, Bunyaviridae, R etroviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Filioviridae. їх детальна характеристика описана в 18 розділі.

Хімічний склад вірусів. До складу вірусів входить нуклеїнова кислота, білок, ліпіди, гліколіпіди, глікопротеїди. Вони завжди міс­ тять один тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), яка становить від 1 % до 40 % маси віріона. Вони характеризуються надзвичайним різномаїттям форм. Геном може бути представлений як односпіральними, так і двоспіральними молекулами, бути лінійними або фрагментованими. Вірусні геноми містять інформацію, достатню для син­ тезу лише декількох білків. їх маса сягає 10'15мг, що в 1 млн разів менше, ніж у клітини, а довжина - до 0,093 мм. Число нуклеотидних пар коливається від 3150 (вірус гепатиту В) до 230000 (вірус нату­ ральної віспи).

Білки вірусів (70-90 %) поділяються на структурні та неструктурні. Структурними називають такі білки, які входять до складу зрілих позаклітинних віріонів. Вони виконують ряд важливих функцій: захищають нуклеїнову кислоту від зовнішнього пошкодження, взає­ модіють з мембранами чутливих клітин і забезпечують проникненя вірусу в клітину, мають РНКта ДНК-полімеразну активність та ін. Неструктурні білки не входять до складу зрілих віріонів, однак утворюються під час їх репродукції. Вони забезпечують регуляцію експресії вірусного генома, є попередниками вірусних білків, здатні пригнічувати клітинний біосинтез. Залежно від розташування у

84

віріоні, білки поділяються на капсидні, суперкапсидні, матриксні, білки серцевини та асоційовані з нуклеїновою кислотою.

Ліпіди містяться в складних вірусах і входять до складу суперкапсИдНої оболонки, утворюючи її подвійний ліпідний шар. Вони стабілі­ зую ть вірусну оболонку, забезпечують захист внутрішніх шарів віріонів від гідрофільних речовин зовнішнього середовища, беруть участь у депротеїнізації віріонів. Віруси мають до 15-35 % ліпідів. Ліпопротеїди - комплекс ліпідів клітинної мембрани та вірусних суперкапсидних білків, які вони набувають при виділенні з клітини під час репродукції.

Молекули вуглеводів входять до складу глікопротеїнів, гліколіпідів, сягаючи 3,5-9 %. Вони відіграють важливу роль, забезпечуючи захист відповідних молекул від дії клітинних протеаз.

Резистентність вірусів до дії факторів зовнішнього середовища.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість до дії факторів зов­ нішнього середовища. Найчутливіші до них віруси, що мають ліпопротеїнову оболонку. Наприклад, віруси грипу, парагрипу, епідеміч­ ного паротиту інактивуються на поверхнях за декілька годин, проте аденовіруси зберігають інфекційні властивості декілька днів. Чутли­ вість вірусів до дії рентгенівського та ультрафіолетового опромінен­ ня залежить від величини генома вірусів: чим менший геном, тим резистентніший вірус до опромінення. Віруси, які мають ліпопротеїдну оболонку, чутливі до ефіру, хлороформу та дезоксихолату натрію, інших жиророзчинників і детергентів.

Важливою особливістю вірусів є їх чутливість до концентрації вод­ невих іонів. Частина з них стійка до кислих значень pH (2,2-3,0). До них належать віруси, які викликають кишкові інфекції, проникаючи в орга­ нізм аліментарним шляхом (віруси поліомієліту, Коксаки, ECHO). Віруси, які потрапляють в організм через верхні дихальні шляхи (риновіруси, віруси грипу та ін.), чутливі до кислих значень pH.

Методи культивування вірусів. Віруси є облігатними внутрішньо­ клітинними паразитами, тому вони можуть репродукуватись тільки в живій клітині. Виходячи з цього, запропоновано три основні способи культивування вірусів: на лабораторних тваринах, курячих ембрі­ онах та культурах клітин.

Лабораторних тварин використовують для виділення вірусів та їх ідентифікації з клінічного, секційного матеріалу в біологічних пробах та реакціях нейтралізації. Для цього служать різноманітні види тварин: білі миші (дорослі та сисунки), гвінейські свинки,

85

хом’яки, кролі, мавпи, яких можна заражати у мозок, внутрішньочеревинно, інтраназально, під шкіру тощо. Залежно від виду збудника, у піддослідних тварин розвиваються характерні ознаки ураження.

Курячі ембріони використовують для виділення вірусів та визна­ чення їх виду. Доступність та відносна дешевизна ембріонів, простота в роботі дозволяють використовувати їх для приготування діагностич­ них препаратів та одержання вакцин. Як правило, працюють з 5-12- 14-денними ембріонами. Зараження проводять відкритим та закритим способом у порожнину алантоїсу, порожнину амніона, на хоріоналантоїсну оболонку, в жовтковий мішок.

Сучасну вірусологічну діагностику важко уявити без використання клітинних культур. Культури клітини поділяють на ряд груп. Первин­ ні культури одержують з тканин людини або тварин при їх фермен­ тативній дезинтеграції за допомогою трипсину, хемотрипсину або версену. Культури можуть витримувати до 10 поділів в умовах in vitro. Вони чутливі до багатьох вірусів, їх можна одержувати в ла­ бораторіях у будь-якій кількості. Найчастіше використовують куль­ тури нирок ембріона людини, нирок мавп, свиней, фібробласти курячих ембріонів.

Перещеплювані культури - клітини, які набули здатності до без­ межного росту. Як правило, вони є похідними пухлин людини або тварин. Такі культури чутливі до багатьох вірусів, мають тенденцію до безмежного росту, тому набули широкого застосування у вірусо­ логічних лабораторіях. їх вирощують у вигляді одношарових культур на поверхні скла у флаконах або суспензії. Використовують тканинні культури HeLa (карцинома шийки матки), Нер 2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини).

Диплоїдні культури - особлива група клітин одного типу, які витримують у лабораторних умовах до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. Вони вільні від контамінації вірусами, мікоплазмами, грибами, онкогенно безпечні, високостабільні. Культури ліній IMR-90 (з легень 16-тижневого плода людини) й J (клітини крові) використовують для одержання вакцинних штамів вірусів.

При розмноженні вірусів в тканинних культурах відбуваються різноманітні зміни клітин. Усю сукупність їх називають цитопатичною дією (ЦПД) або цитопатичним ефектом (рис. 22). Одні ві­ руси викликають повну деструкцію (руйнування) клітин і відпадання їх моношару від стінки пробірки чи флакона. Так діє, наприклад,

86

вірус поліомієліту. Інші віруси викликаю ть у клітинах різйого ступеня дегенеративні зміни яд­ ра й цитоплазми, появу специфічних включень тощо. Таку цитопатичну дію проявляють віруси

натуральної ВІСПИ, ска- рис 22. Культура клітин нирок ембріона свині: зу, аденовіруси, герпес- а - нормальні клітини; б - ципатична дія вірусів

віруси. При зараженні культури вірусом кору або респіраторносинцитіальним вірусом утворюються гігантські багатоядерні відростчаті клітини - так звані синцитії та симпласти. Онкогенні віруси викликають ЦПД у вигляді клітинної проліферації, що зумовлює утворення пухлин.

Репродукція вірусів. Здатність вірусів до відтворення називають репродукцією. Особливості її полягають у тому, що геноми представ­ лено як РНК, так і ДНК, вони різноманітні за структурою і формою, майже всі вірусні РНК здатні реплікуватись незалежно від ДНК клітини, вірусам притаманний диз’юнктивний спосіб репродукції. Останній полягає в тому, що синтез генома та білків вірусу розір­ ваний у просторі та часі: нуклеїнові кислоти реплікуються в ядрі клітини, білки - в цитоплазмі, а збирання цілих віріонів може відбу­ ватись на внутрішній поверхні цитоплазматичної мембрани. Репро­ дукція вірусіз - унікальна система відтворення чужерідної інформації в клітинах еукаріотів і забезпечує абсолютне підкорення клітинних структур потребам вірусів.

В репродукції вірусів виділяють ряд стадій. До ранніх належить адсорбція вірусів на поверхні клітини, проникнення (пенетрація) їх всередину клітини та їх роздягання (депротеїнізація). Пізні стадії (стратегія вірусного генома) включають синтез вірусних нуклеїнових кислот, синтез білка, збирання віріонів та вихід вірусних часток із клітини.

Прикріплення вірусів до поверхні клітини забезпечується двома механізмами: неспецифічним і специфічним. Неспецифічний визнача­ ється силами електростатичної взаємодії, що виникає між хімічними групами на поверхні вірусів і клітин, які несуть різні заряди. Спе­ цифічний механізм (обернена та необернена адсорбція) зумовлюється комплементарними вірусними та клітинними рецепторами. Вони

87

можуть мати білкову, вуглеводну, ліпідну природу. Наприклад, рецептором для вірусів грипу є сіалова кислота. Число рецепторів на ділянках адсорбції може сягати 3000. На поверхні вірусів рецеп­ тори, як правило, розташовані на дні заглибин і щілин.

Проникнення вірусів всередину клітини відбувається за механіз­ мом рецепторного ендоцитозу (варіант віропексису) на спеціальних ділянках клітинних мембран, які містять особливий блок з високою молекулярною масою - клатрин. Мембрани інвагінуються, і утворю­ ються вкриті клатрин ом внутрішньоклітинні вакуолі. їх число може сягати 2000. Вакуолі, об’єднуючись, утворюють рецептосоми,а остан­ ні зливаються з лізосомами. Поверхневі білки вірусів взаємодіють із мембранами лізосом, а їх нуклеопротеїд виходить у цитоплазму.

Однак існує ще один механізм проникнення вірусів у клітину - індукція злиття мембран. Вона відбувається завдяки особливому вірусному білку злиття (F - білок, fusion - злиття). Внаслідок цього процесу вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а геном його проникає в клітину. Такий білок іденти­ фіковано у вірусів грипу, парагрипу, рабдовірусів та ін.

Роздягання віріонів - багатоступеневий процес, під час якого вивільняється їх нуклеїновий апарат, зникають захисні оболонки, які гальмують експресію генома. Відбувається воно в спеціалізованих ділянка - лізосомах, апараті Гольджі.

Пізні стадії репродукції спрямовані на синтез вірусних нуклеїнових кислот та білка. Механізм реплікації (утворення вірусних геномів, які є точною копією попередника) залежить від особливостей нуклеї­ нової кислоти. У різних видів вірусів він неоднаковий. Виділяють 6 основних класів реплікації вірусів.

У двониткових ДНК-містких вірусів (герепесвіруси, аденовіруси, віруси натуральної віспи) спочатку відбувається деспіралізація ДНК і розходження її ниток. На одній з них за принципом комплементарності синтезується нова нитка ДНК, на другій - інформаційна (мат­ рична) РНК (ІРНК або мРНК). Цей процес триває, поки в клітинах не утвориться достатня кількість нуклеїнових кислот. У однониткових ДНК-геномних вірусів процес відбувається за умови утворення про­ міжної форми ДНК.

Реплікація у вірусів, що містять РНК, відбувається за подібни­ ми закономірностями. На материнській РНК синтезується ІРНК, а матрицею для синтезу вірусного генома служать проміжні форми РНК.

88

Суттєво відрізняється від попередніх механізм реплікації онкорнавірусів. їх процес репродукції тісно пов’язаний з репродукцією клітини-хазяїна. Спочатку на РНК-місткому геномі вірусу відбуваєть­ ся синтез нитки ДНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази. За деякий час синтезується комплементарна нитка ДНК, яка надалі інтегрує в геном клітини-хазяїна. В такому стані вірус тривалий час уберігається в клітині. Пізніше ця нитка ДНК служить матрицею для утворення вірусної РНК.

Транскрипцією називають процес утворення інформаційних (мат­ ричних) РНК. Вона відбувається за допомогою спеціальних ферментів, які називаються ДНКабо РНК-залежні РНК-полімерази. У ДНКвірусів ці ферменти клітинного походження, а у РНК-вірусів - власні вірусспецифічні транскриптази.

На стадії трансляція відбувається зчитування генетичної інформа­ ції з матричної РНК та перевід її у послідовність амінокислот. Від­ бувається процес у рибосомах. Молекули РНК просуваються в рибо­ сомах відповідно до послідовності триплетного коду, який розпізна­ ють транспортні РНК. Останні несуть на спеціальних ділянках аміно­ кислоти.

Складання віріонів - не до кінця вивчений процес. В його основі лежить можливість специфічного розпізнавання нуклеїнових кислот і вірусних білків при досягненні їх певної концентрації. Підраховано, що для утворення однієї вірусної частки необхідно біля 10 тисяч молекул білків, ліпідів, вуглеводів, нуклеїнових кислот. Прості віріони складаються на мембранах ендоплазматичного ретикулюму. У складних вірусів він починається в аналогічних ділянках, а закінчу­ ється на цитоплазматичній мембрані.

Прості віруси залишають клітину, як правило, шляхом “вибуху”, розриваючи її мембрану. Складні віруси - брунькуванням. При цьому клітина тривалий час може залишатись життєздатною, поки повніс­ тю не виснажиться, продукуючи вірусних нащадків.

Типи вірусної інфекції. При взаємодії вірусів з клітиною проявля­ ється декілька типів такої взаємодії. При продуктивній інфекції вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбуваєть­ ся незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При Цьому утворюється нове покоління вірулентних вірусів.

Якщо цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюється, такий тип взіємодії позначають

як абортивний.