Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

протидифтерійну сироватку та налагодили її виробництво. Тут плід­ но працювали Л.О. Тарасевич, О.М. Безредка, В.М. Хавкін. Всі вони потім навчалися і проводили наукові дослідження у лабораторії Мечникова в Інституті Пастера і стали всесвітньо відомими вченими.

Г.М. Мінх увійшов в історію знаменитим дослідом самозараження поворотним тифом. Він ввів собі кров хворого, тяжко захворів, а потім дослідив власну кров і побачив у ній спірохет, що дало мож­ ливість відрізнити поворотний тиф від висипного.

О.О. Мочупсовський ввів собі кров хворих на висипний і поворотний тифи, сам захворів спочатку висипним, а потім поворотним тифом. Він довів, що збудник висипного тифу знаходиться в крові хворих.

Протягом останніх ЗО років серед одеських мікробіологів важливе значення мали наукові праці ВЛ. Тульчинської в галузі морської мікробіології та CM. Мінервіна з проблем анаеробної газової інфекції, правця, ботулізму, потенціювання бактерійних токсинів.

Славетною була і є київська школа мікробіологів. Засновником і першим завідувачем кафедри мікробіології Київського медичного інституту був М.П. Нещадименко, відомий своїми працями в галузі імунології та вивченні ролі стрептококів у патології людини. Главою київських мікробіологів того періоду був В.В. Підвисоцький. Мікро­ біологічний напрям його наукової діяльності - механізм розвитку інфекційного процесу та імунітету, паразитизм в злоякісних пухли­ нах. Одним з талановитих його учнів був IT. Савченко, який потім заснував Бактеріологічний інститут у Казані та був його директором.

Важливі теоретичні та практичні проблеми медичної мікробіології розробив академік ВТ. Дро­ ботько, зокрема, він вивчав біологію капсульних і кишечних бактерій, мінливість мікроорганізмів, бактеріофагію, фітонциди й антибіотики з вищих рослин. Протягом ЗО років він був директором Інституту мікробіології і вірусології АН України.

Величезний вплив на світогляд українських мікробіологів і епідеміологів мала наукова та гро­ мадська діяльність академіка JIB. Громашевського.

ВТ. Дроботько Він грунтовно розробив вчення про механізми передачі інфекції та наукову класифікацію інфекційних хвороб. В його класичних дослідженнях з епідеміології холери, черевного ти­ фу, дизентерії та гепатиту встановлена роль мух у перенесенні збуд­ ників цих хвороб та розкритті причин сезонності захворювань.

20

С.С. Дяченко

Громашевський написав фундаментальні підруч­ ники з загальної та спеціальної епідеміології, які перевидавалися кілька разів.

До видатних українських вчених у галузі медичної мікробіології належить С.С. Дяченко (1898-1992). З 1943 р. по 1973 р. очолював кафедру мікробіології Київського медичного інституту. Вперше провів блискуче дослідження антигену вірулентності збудника черевного тифу. Фунда­ ментально вивчив фізіологічні механізми імуні-

Л.В. Громашевський тету, ЄТІОЛОГІЮ І Лабораторну діагностику тифів, сальмонельозів, лептоспірозів та збудників деяких вірусних інфекцій. Під­ сумком цих важливих робіт стали класичні посіб­ ники “Мікробіологічні методи діагностики інфек­ ційних хвороб” і “Патогенні віруси людини”.Всьо­ го ним опубліковано 220 робіт, 12 з яких - моно­ графій. С.С. Дяченко вніс вагомий вклад у фор­ мування української школи мікробіологів і віру­ сологів. Він підготував 4 доктори та 55 кандидатів наук

Вагомий вклад у розвиток загальної, медичної, промислової та сільськогосподарської мікробіології і екології внесли грунтовні дослі­ дження Є.І. Квасникова. Велику теоретичну й практичну цінність мають його роботи, присвячені групі молочнокислих, коринеформних та вуглецезасвоюючих мікроорганізмів.

Перу В.Й. Білай належить близько 300 робіт, в тому числі 16 монографій, присвячених досконалому вивченню грибів, їх токсинів, продуцентів антибіотиків та інших біологічно активних речовин.

Для розвитку й становлення мікробіологічної науки в Україні багато зробила і харківська школа бактеріологів. Зокрема ВІ. Недригайлов був одним із засновників Бактеріологічного інституту в Харкові (нині Інститут мікробіології та імунології ім. II. Мечникова). Основні його роботи торкаються різних проблем імунології.

Видатний мікробіолог і епідеміолог С.І. Златогоров разом із Д.К. Заболотним виїздив у складі наукових експедицій на боротьбу з епідеміями чуми, холери, віспи. Найбільш продуктивною була діяльність Златогорова, коли він працював завідувачем кафедри мікробіології Харківського медичного інституту, особливо при

21

вивченні збудника скарлатини й мінливості бактерій. Він виховав ряд відомих мікробіологів - В.С. Деркача, ММ. Цехновіцера, БЛ. Палант та ін.

Л.С. Ценковський, творчо використавши метод Пастера, розробив оригінальні вітчизняні сибіркові препарати (вакцини Ценковського). Вони швидко завоювали популярність і успішно застосовувались в Україні протягом 85 років, рятуючи отари овець та інших тварин від згубних епізоотій сибірки.

Крім цих основних мікробіологічних шкіл, в Україні були й інші відомі вчені, які збагатили нашу науку вагомими здобутками.

В Сімферополі довгий час працював К.Д. Пяткін, який досконало вивчив мінливість збудника дифтерії та патогенез цього захворюван­ ня, успішно розв’язав окремі питання генетики бактерій і вірусів. Його підручник “Медична мікробіологія” виходив декілька разів українською, російською та англійською мовами.

На кафедрі мікробіології Дніпропетровського медичного інсти­ туту протягом 25 років працював ветеран української мікробіології Ю.І. Деміховський. Він виділив вірус Алма-Атинського енцефаліту, довів роль ешеріхій в етіології гемоколітів у дітей, застосував інгаля­ ційний метод вакцинації проти кишкових і ранових інфекцій, сформу­ вав науковий напрямок по вивченню захисної ролі бактерій - про­ дуцентів перекису водню.

Мікробіологічна наука в Україні знаходиться на такій стадії роз­ витку, що може внести великий вклад у добробут і здоров’я людей. Вона дала дивовижні відкриття в минулому, відіграє значну роль у багатьох сферах людського життя сьогодні й без сумніву буде ве­ ликою наукою майбутнього.

Матеріали до практичного заняття

1. Мікробіологічна лабораторія та її обладнання

Мікробіологічна лабораторія - спеціальна науково-практична ус­ танова, в якій проводять бактеріологічні, імунологічні й серологічні дослідження. їх організовують при клінічних лікарнях, санітарноепідеміологічних станціях, профільних науково-дослідних інститутах. У складі великих санітарно-епідеміологічних станцій існують лабора­ торії з діагностики особливо небезпечних інфекцій, вірусологічні тощо.

22

Мікробіологічні лабораторії в лікувально-профілактичних уста­ новах проводять аналізи для ранньої діагностики інфекційних хвороб

івизначення строків виписування хворого з лікувального закладу.

Ускладі санітарно-епідеміологічних станцій крім діагностичної роботи вони здійснюють мікробіологічні обстеження окремих осіб і організо­ ваних колективів, переважно з підприємств громадського харчування й джерел водопостачання, на носійство патогенних кишково-тифоз- них бактерій, стафілококів (у медперсоналу лікарень), збудників дифтерії, епідемічного менінгіту й інших хвороб. Контролюється також бактерійна забрудненість змивів з устаткування, інвентаря й рук персоналу пологових будинків, хірургічних стаціонарів, дитячих закладів тощо.

Матеріалом для мікробіологічних досліджень частіше всього є виділення хворої людини: сеча, випорожнення, блювотні маси й про­ мивні води шлунка, мокротиння, слиз із зіва, жовч, а також кров, спинномозкова рідина, трупний матеріал. При дослідженні екології мікроорганізмів матеріалом служать вода, повітря, грунт, харчові продукти, змиви з різних об’єктів, перев’язувальні й шовні матеріа­ ли, ліки. Нормальну мікрофлору людини досліджують, забираючи матеріал стерильним тампоном із носота ротоглотки, наліт із зубів, слиз із вагіни, змив зі шкіри й випорожнення.

Основна вимога до бактеріологічних лабораторій - створити такі умови, які забезпечують проведення досліджень при дотриманні стерильності й гарантують персоналу та оточуючим безпеку від можливого зараження.

Уструктуру звичайної мікробіологічної лабораторії входить ряд приміщень спеціального призначення: одна або декілька лаборатор­ них кімнат, бокс із передбоксником, препараторська, приміщення для виготовлення живильних середовищ, автоклавна (стерилізацій­ на), термостатна, мийка, кімната для забору (або прийому) матеріа­ лу для дослідження і його реєстрації, віварій для лабораторних тварин.

Лабораторна кімната первинна бути світлою й просторою, з орієнта­ цією вікон на північ або північний захід. Це - основне приміщення для проведення досліджень. Жорсткий протиепідемічний режим ро­ боти вимагає її щоденного вологого прибирання та щомісячного проведення дезинфекції підлоги, стін, столів та обладнання. Робочі

столи покривають спеціальним пластиком, підлогу - лінолеумом, а стіни - масляною фарбою. У лабораторії доцільно виділити й

23

обладнати окремі робочі місця та закріпити їх за кожним співробіт­ ником.

На робочому столі повинні знаходитись тільки предмети, необхідні для проведення бактеріологічних досліджень: газовий пальник, банка з дезинфікуючим розчином, пастерівські й градуйовані піпетки, бактеріальна петля і шпателі, пінцети, предметні та покривні скельця, штативи, пробірки, чашки Петрі, мікроскоп, аглютиноскоп, лупа. Біля стола повинна стояти посудина з дезрозчином, куди опускають відпрацьований заразний матеріал, який потім автоклавується.

Для проведення бактеріологічних (вірусологічних) досліджень в особливо стерильних умовах відводять окрему кімнату або бокс, приміщення якого розраховують на роботу двох чоловік. Перед про­ веденням дослідження його обробляють дезинфікуючими розчинами, а повітря стерилізують бактерицидними лампами БУВ-15, БУВ-30 протягом 1-2 год.

При проведенні мікробіологічних досліджень у лабораторії спів­ робітники повинні дотримуватись протиепідемічного режиму і вста­ новлених правил роботи:

1.До роботи в бактеріологічній лабораторії допускаються особи, які обізнані з правилами роботи в ній.

2.Персонал лабораторії повинен мати індивідуальний спецодяг (халат, шапочку, взуття). У боксі працюють у стерильних халатах, шапочках і марлевих масках. При зараженні й розтині тварин одя­ гають фартух, нарукавники й гумові рукавички.

3.Палити, вживати їж у й зберігати продукти в лабораторії категорично заборонено.

4.Матеріал, що надходить в лабораторію для дослідження, завж­ ди вважають інфекційним, його обов’язково записують у спеціаль­ ний журнал і маркірують.

5.Відпрацьовані культури мікробів, заразний матеріал підлягають обов’язковому щоденному знищенню. Поверхню робочого місця, як і використані інструменти, дезинфікують.

6.Переливати рідини, які містять патогенні мікроби, необхідно над посудиною з дезинфікуючим розчином. При набиранні таких рідин

впіпетки потрібно користуватися гумовими балонами або грушами.

7.Коли при розбиванні колби чи пробірки заразний матеріал або жива культура потрапляє на робочий стіл, інші меблі, одяг, руки, підлогу, треба негайно повідомити про це завідувача лабора­ торією або лікаря-бактеріолога і в його присутності провести

24

дезинфекцію заражених ділянок, потім обробити руки дезрозчином

іретельно вимити з милом.

8.У лабораторії не дозволяються зайві ходіння, різкі рухи, непот­ рібні розмови. Виконання цих вимог попереджує проникання сторонніх мікробів із повітря й ротової порожнини в досліджуваний матеріал.

9.Необхідно завжди уникати втрат і виносу з лабораторії зараз­ ного матеріалу, живих культур та інфікованих тварин. Усі термоста­ ти, рефрижератори і сейфи з культурами потрібно обов’язково пломбувати. Контролює виконання цих правил завідувач лаборато­ рією або лікар-бактеріолог.

10.Після закінчення роботи столи дезинфікуються, проводиться вологе прибирання лабораторії з використанням дезинфікуючих розчинів.

Правила поводження з живими культурами, які виділяються в процесі досліджень, а також із музейними штамами мікроорганізмів, залежно від ступеня їх патогенності, регламентуються відповідними інструкціями.

Для проведення мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб

усучасних лабораторіях використовують різні методи. Бактеріоскопічний (вірусоскопічний) - виготовлення й забарвлення

мазка з матеріалу від хворого і вивчення його під мікроскопом. Він дає змогу швидко вивчити характерні особливості збудника й має велике значення при діагностиці гонореї, менінгіту, туберкульозу, сифілісу, поворотного тифу, віспи, малярії, лейшманіозу, токсо­ плазмозу тощо.

Бактеріологічний метод зводиться до посіву матеріалу від хворого на живильні середовища, виділення чистої культури збудника й визначення його виду, а, отже, і встановлення остаточного діагнозу захворювання.

Серологічний метод базується на виявленні специфічних антитіл у сироватці крові хворих до певного виду збудника. Для цього використовують різні імунологічні реакції: аглютинації, преципітації, зв’язування комплементу тощо.

Біологічний (експериментальний) метод полягає у зараженні чутливих лабораторних тварин виділеною чистою культурою збуд­ ника або введенні його токсинів і відтворенні типової картини за­ хворювання. Для цього використовують білих мишей, щурів, гві­ нейських свинок, кроликів. Цим методом визначають і вірулентність мікробів.

25

Алергічний метод дає змогу встановити діагноз за допомогою внутрішньошкірних алергічних проб, які виявляють специфічний стан підвищеної чутливості до збудника чи продуктів його життєді­ яльності (алергенів).

2. Світловий мікроскоп і його будова. Правила роботи з імерсійною системою. Фазово-контрастна, люмінесцентна,

електронна мікроскопія

Рис. 1. Мікроскоп

МБР-1

Мікроорганізми дуже малі за своїми розмірами, так що побачити їх неозброєним оком неможливо. Для їх виявлення й вивчення використовують складні прилади - мікроскопи. Сучасна промисловість ви­ пускає багато видів мікроскопів залежно від їх при­ значення

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлюваної частин. До механічної частини входять: штатив, тубус, “револьвер”, предметний столик, макро- й мікрогвинт. До оптичної частини відносять об’єктиви й окуляри. До освітлювальної частини - дзеркало й конденсор (рис. 1).

Уверхній частині штатива є тубус у який вставляється окуляр,

азнизу він має “револьвер”- пластину, що обертається по колу, в отвори якої вгвинчені 3-4 об’єктиви. Обертаючи “револьвер”, можна встановити будь-який об’єктив під отвір тубуса. Останній пересува­ ється за допомогою макро- й мікрометричного гвинтів. Для грубого наведення тубуса користуються макрогвинтом. Більш точно це роб­ лять за допомогою мікрогвинта, що дає чітке зображення досліджу­ ваних об’єктів. Мікрометричний гвинт є однією з найбільш тендітних частин мікроскопа й вимагає обережного поводження з ним.

Предметний столик має круглу або прямокутну форму, в його центрі знаходиться отвір, над яким вміщують предметне скло з препаратом. У більш досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеціальних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикулярних напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (х8, х40) та імерсійні (х90, ХІ20). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою і предметним склом яких

26

знаходиться повітря. При цьому, в зв’язку з різницею показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єк­ том знаходиться кедрова, персикова олія, “імерсіол”, кофіцієнт за­ ломлення яких такий самий, як і в скла. При дослідженні мікроорга­ нізмів користуються переважно імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить від об’єктива. Існують окуляри з такими збільшеннями: х7, хІО, х15. Ці цифри позначені на них.

Загальне збільшення мікроскопа дорівнює добуткові збільшення об’єктива на збільшення окуляра. Наприклад, комбінація імерсійного об’єктива з показником збільшення х90 й окуляра хІО дає збільшення у 900 разів. Максимальне збільшення сучасних мікроскопів досягає 2000-3000. Однак, якість мікроскопа визначається не тільки ступенем збільшення об’єкта, а й властивою йому, так званою роздільною здатністю. Це та найменша відстань між двома точками, зображення яких виразне під мікроскопом. Роздільна здатність сучасних імерсій­ них об’єктивів знаходиться в межах 0,2 мкм.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спря­ мовує пучок світла в конденсор, а через нього - в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала плоский, другий - вігнутий. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка променів в одній точці (фокус) яка знаходиться в площині досліджува­ ного препарату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня предметного столика, з штучним - опускати доти, поки зображення джерела світла не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів конденсор також опус­ кають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діа­ фрагмою, яка знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при відкритій, а незабарвлені - при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покра­ щується зображення та розширюються межі видимості. Перше

27

досягнуто появою мікроскопів-бінокулярів, друге - дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це дає ряд переваг при мік­ роскопуванні. Досліджуваний препарат розглядаєть­ ся відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночасно досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність (рис. 2).

Рис. 2. Мікроскоп МБР-3

Правила роботи з імерсійною системою:

1.Підняти конденсор Аббе до рівня предметного столика, повністю відкрити іріс-діафрагму.

2.Користуючись об’єктивом 8, за допомогою плоского дзеркала досягти максимального освітлення поля зору.

3.На предметному столику розмістити забарвлений препаратмазок, нанести на нього кедрову олію і закріпити клемами.

4.Повертаючи револьвер, встановити над препаратом імерсійний об’єктив 90, під контролем зору занурити його в краплю кедрової олії.

5.Дивлячись в окуляр лівим оком (не закриваючи правого), спо­ чатку макрогвинтом знайти контури зображення, а потім мікрогвинтом досягти максимальної чіткості, вивчити й замалювати препарат.

6.Після закінчення роботи підняти тубус, зняти предметне скло, обережно витерти серветкою імерсійний об’єктив від кедрової олії, повернути його в бік, опустити тубус.

Темнопольний мікроскоп (ультрамікроскоп) відрізняється від зви­ чайного способом освітлення препарата. У звичайному мікроскопі об’єкт досліджується при світлі, яке проходить, в темнопольному - при боковому освітленні. Для цього звичайний конденсор Аббе замі­ нюють спеціальним параболоїд-конденсором, у якому центральна частина нижньої лінзи затемнена, а бокова поверхня дзеркальна, в результаті чого утворюється темне поле зору. Яскраві бокові промені, відбиваючись від дзеркальної поверхні, фокусуються в площині об’єкта, але в очі мікроскопіста не потрапляють. В окуляр проникають лише ті промені, які відбиваються від самого об’єкта. Одже, на

28

темному полі зору будуть видимі яскраві об’єкти (мікроби). Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02-0,04 мікро­ метра, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Мікроскопію в темному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення збудників лептоспірозу, сифілісу, поворотного тифу. Але в темнопольному мікроскопі не можна добре вивчити внутрішню стуктуру мікроорганізмів. Для цього запропоно­ вані видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та люмінесцентна.

Фазово-контрастна мікроскопія - спосіб мікроскопічного дослі­ дження прозорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникаючих променів. У різних ділянках клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неоднакові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помі­ чають. Але їх можна зробити видимими за допомогою фазово-конт- растного пристрою. При роботі з останнім об’єкти виглядають більш темними (позитивний фазовий контраст) або світлішими (негативний контраст) у порівнянні з оточуючим фоном.

Фазово-контрастна мікроскопія не збільшує роздільної здатності, але дозволяє виявити нові деталі внутрішньої структури бактерійної клітини, дослідити окремі стадії її розвитку, поділ, вплив різноманіт­ них хіміотерапевтичних препаратів. Вона має й деякі недоліки: нав­ коло об’єктів виникають світлі ореоли. Значні переваги перед фазовоконтрастним пристроєм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія. Аноптральний мікроскоп є різновидом фазово-контрастного. Він дає змогу досліджувати такі малоконтрастні живі об’єкти, як бактерії, гриби, найпростіші, але з більшою конт­ растністю, роздільною здатністю, стереоскопічністю і чіткістю зобра­ ження. Суттєвою деталлю аноптрального мікроскопа є спеціальна лінза об’єктива, яка розташовна поблизу її верхнього отвору і на яку нанесено шар кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору коричневим.. Досліджувані клітини при цьому набувають різних від­ тінків: від білого до золотисто-коричневого.

Люмінесцентна мікроскопія - метод мікроскопії, який дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію (світіння) мікро­ організмів, клітин, тканин або окремих їх структур. Він базується

29