Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

Синтез вуглеводів відбувається або з вуглекислого газу (автотро­ фи), або за рахунок вуглецемістких органічних сполук.

Як було зазначено, ліпіди мікроорганізмів представлено насичени­ ми та ненасиченими жирними кислотами, фосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. Мікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за участю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою клітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включа­ ються до складу фосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших ліполітичних ферментів.

Ферменти мікроорганізмів. Усі біосинтетичні процеси та інші метаболічні перетворення в клітині відбуваються за участю особливих високоактивних біологічних каталізаторів, які називаються фермента­ ми. Вони належать до 6 класів: гідролази (забезпечують реакції роз­ щеплення за участю води), оксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть участь у процесах дихання), ізомерази (здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси ізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних субстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеп­ лення хімічних груп негідролітичним шляхом), лігази (відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахунок енергії АТФ).

Здатність утворювати певні ферменти кодується клітинним гено­ мом і є постійною ознакою бактерій. Так як бактеріальна клітина зай­ має невеликий об’єм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів синтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої групи постійно присутні в бактерії в певних концентраціях. Вони зумовлюють першо­ чергові біосинтетичні потреби клітин.

Клітина виділяє ферменти в навколишнє середовище (екзоферменти). Там вони здійснюють контактне позаклітинне перетравлюван­ ня речовин або пошкоджують тканини організму господаря. Ендоферменти локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в периплазматичному просторі.

Роль ферментативної діяльності мікроорганізмів важко переоціни­ ти. Вони мають загальнобіологічне значення. Відома участь бактерій у кругообізі речовин у природі, формуванні родовищ корисних копа­ лин (нафта, вугілля, поклади сірки). Мікроорганізми - прекрасні санітари довкілля. Вони здатні біодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє середовище.

70

Людина поставила мікробні ферменти собі на службу. їх широко використовують у різних галузях хімічної, харчової, фармацевтич­ ної, парфумерної промисловостей, сільському господарстві, медицині.

Протеазами видаляють волосяний покрив зі шкір тварин, зніма­ ють желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що забезпечують бродіння, використовуються для одержання бутанолу, ацетону, необ­ хідних для проведення хроматографічних досліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти - кефір, йогурт, кисляк, кумис - також продукти діяльності бактерій бродіння.

Мікроорганізми використовуються у виноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла, силосуванні кормів, ква­ шенні овочів. Із дріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як живильне середовище використовують парафіни - відходи нафти.

За допомогою мікроорганізмів та їх ферментних систем в медичній промисловості одержують гормони гідрокортизон, преднізолон, різ­ номанітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують віта­ міни (В12). Зі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу і стрептокіназу, які руйнують тромби в кровоносних судинах.

Оскільки здатність утворювати ферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко використовується в ла­ бораторній практиці для ідентифікації бактерій. Її проводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, ліполітичних та інших ферментів.

Енергетичний метаболізм прокаріотів. За своїм об’ємом реакції, що забезпечують клітину внутрішньою енергією, значно перевищу­ ють біосинтетичні процеси.

Мікроорганізми можуть використовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні користуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтезуючі бактерії) та хімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова енергії.

Явище нагромадження енергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту протонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, а електрони передаються на відповідні молекули-акцептори.

Протягом своєї еволюції бактерії виробили три способи одержан­ ня енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.

При бродінні в анаеробних умовах у певних окислювально-віднов- них реакціях утворюються нестабільні молекули, фосфатна група

71

яких містить багато вільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти (АДФ), яка перетворюється в АТФ. Реакції, в яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстратного фосфорилювання. Відновлювач, який при цьому утворюється, (НАД*Н2, відновлений фередоксин), переносить електрони на ендо­ генний акцептор (піруват, ацетальдегід) або звільняється у вигляді

водню.

Окислення відбувається внаслідок переносу електронів через спе­ ціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембра­ ні. Він складається з набору переносників і в більшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до н 20.

Основою фотосинтетичних процесів у представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними пігментами: флавопротеїнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять негемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення

енергії.

Енергія, яку генерує клітина, запасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню - Дцн+ або в молекулах АТФ.

Прокаріоти містять декілька сполук із високоенергетичними фос­ фатними зв’язками - ацилфосфати, фосфоенолпіруват, аденозинфосфосульфат, а також сполуки з тіоефірним зв’язком - ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. Перенос її веде до розриву зв’язку, з’єднуючого з молекулою, отже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєд­ нання такої групи до молекули акцептора підвищує рівень його віль­ ної енергії, переводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних реакціях.

Найголовніше місце в переносі хімічної енергії належить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та мембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється фосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергічних зв’язки, які при гідролізі звільняють 31,8 кДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі розміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки клітини, де необхідна енергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля 10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.

На прикладі E. coli визначено, скільки необхідно енергії, щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль АТФ,

72

із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль - на синтез ДНК і РНК, 2 ммоль - для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання життєдіяльності - осмос, рух клітини тощо.

Іншою універсальною клітинною енергією є енергія трансмембран­ ного потенціалу Ацн+. Це здійснюється за допомогою спеціальної “петлі”, локалізованої в цитоплазматичній мембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої сторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а протони вивільняються в зовнішнє середовище.

При такому переносі назовні клітини накопичуються іони водню, середовище підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває більш лужного характеру. Виникає орієнтований попе­ рек ЦПМ градієнт іонів водню. Оскільки Н+ - хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення з обох сторін ЦПМ викликає створення не тільки концентраційного градієнта часток, але й орієн­ тованого поперек мембрани електричного поля. Напруга потенціалу Дцн+ досягає 200-250 мВ.

Енергія трансмембранного потенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного АТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного фосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може проходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідро­ лізі АТФ зростає енергія Дцн+ на ЦПМ.

Таким чином, дані реакції є природними механізмами, які з ’єдну­ ють процеси окислення з фосфорилюванням. Енергія, яка накопичу­ ється на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні потреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює рух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та іонів через мембрану, а енергія АТФ - синтетичні процеси в клітині.

Але ні енергія Дцн+, ні АТФ не можуть нагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже тривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії прокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахари­ дів, ліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, вкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

73

Дихання бактерій

Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони від­ новлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі кисню. У 1863 р. він запропонував терміни “аероб” та “анаероб”.

Сьогодні, залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп. Облігатні аероби - мікроорга­ нізми, для оптимального росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На по­ верхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки. Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при від­ сутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спе­ ціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких ство­ рюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентними газами (азотом, воднем). Факультативні анаеро­ би (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середо­ вища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та нав­ паки. Групу факультативних анаеробів формують численні представ­ ники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бакте­ ріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представни­ ками є збудники бруцельозу бичачого типу.

74

В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцеп­ тор електронів у реакціях, що каталізуються цигохромоксидазами та оксигеназами. У клітинах факультативних анаеробів також є цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталі­ зують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

Детальне* вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб відбу­ лось переключення механізму бродіння на аеробне дихання, достат­ ньо було 0,2 % кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв’язана.

Ріст і розмноження бактерій

Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Під ростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і від­ повідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження - це здат­ ність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю об’єму середовища

Розмноження бактерій - складний процес, пов’язаний із синхрон­ ною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу - ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається, реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої в місці з’єднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розхо­ дяться. Кожна з них є матрицею, на якій за принципом комплементарності синтезуються їх копії, які згодом об’єднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис нуклеотидів, які пізніше зшиваються фермен­ том лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.

Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона

75

оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перего­ родки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складати­ муться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних мікробів синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають зв’язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм.

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий - такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип - із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому утворюються багатонуклеоїдні форми бактерій.

Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбу­ вається в різних площинах. Це спричиняє, наприклад, утворення різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів - диплоко­ ків, стафілококів, тетракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмно­ жуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення клітин, подібних до спор, конідій.

Облігатні внутрішньоклітинні паразити - хламідії - розмножу­ ються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується нове покоління елементарних тілець. Тривалість циклу складає 4048 годин.

Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись і простим бінарним поділом.

Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факто­ рів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окис- но-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні ЗО хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 - мільйони. Через 35 год їх об’єм становитиме до 1000 м3, а маса - понад 400 т.

При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, дося­ гаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти

76

обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періо­ дичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з генетично

обм еж еним ростом.

Крива, яка описує за­
леж ність логарифму чис­
ла живих клітин від часу
культивування, назива­
ється кривою росту.
Розрізняють чотири
основні фази росту періо­
дичної культури: почат­
кову (або лаг-), експо­	Рис. 19. Крива росту бактеріальної популяції:
ненціальну (або логариф­	1 - початкова фаза; 2 -	експоненціальна фаза;
мічну), стаціонарну та	З - стаціонарна фаза; 4	- фаза відмирання

відмирання (рис. 1.9).

Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бак­ терій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.

Експоненціальна (логарифмічна) фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії. Вона залежить від віку мікробів і складу се­ редовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи - ЗО хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час, протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази - 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збіль­ шуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит жи­ вильних речовин у середовищі, низький парціальний тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин познача­ ють як максимальну (М-) концентрацію, а величину біомаси - термі­ ном вихід або урожай. Ця ознака є специфічною й характерною для кожного виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних

77

речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом власних ферментів.

Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціального росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням живильного середовища, додат­ ковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати - прилади, які дозволяють про­ водити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах.

Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища.

Культивування мікроорганізмів

Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяль­ ності мікроорганізмів.

В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тварин­ ного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використо­ вувати й замінники м’яса - плаценту, кров’яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живиль­ них речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати - кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

78

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, нат­ рію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, акти­ воване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму pH середо­ вища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну в’язкість, густину (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, про­ зорими й обов’язково стерильними.

Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеці­ альні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові се­ редовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі й щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морсь­ ких водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманіт­ них субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганіз­ мів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи.

Перша група - універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: м’ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пеп- тонний агар (МПА). За сво’ім складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

79