Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

Методика виявлення спор. На незафарбованому препараті ендоспори живих бактерій мають чорні краї та яскраво світяться у площині, дещо вище положення справжнього фокуса.

При використанні негативного контрастування 7 % розчин вод­ ного нігрозину змішують на покривному скельці з петлею культури, роблять тонкий мазок, який висушують на повітрі. Покривне скельце перевертають мазком донизу, кладуть на предметне скло, фіксуючи його воском або вазеліном. Ендоспори видно як сферичні або еліпсовидної форми об’єкти, які сильно заломлюють світло.

За методом Ожешко на нефіксований препарат наливають 0,5 % розчин хлористоводневої кислоти і підігрівають 1-2 хв на полум’ї. Піля цього з препарата зливають рештки кислоти, промивають водою, після висихання фіксують у полум'ї та забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Спори набувають червоного кольору, а тіла мікробних клітин - голубого (рис. 16, вкл.).

Методика виявлення джгутиків. Процес забарвлення джгутиків складний і вимагає особливої ретельності від мікробіолога, оскільки товщина джгутика (10-30 нм) менше роздільної здатності мікроскопа,

іщоб їх розглянути, потрібно в першу чергу штучно збільшити їх діаметр.

Скельця для препарата повинні бути абсолютно чистими та зне­ жиреними. Як правило, використовують нові скельця після відповід­ ної обробки.

Принцип методу Леффлера полягає в тому, що петлю 18-годинної агарової культури мікробів змішують із водопровідною водою і обе­ режно відтягнутим кінцем пастерівської піпетки наносять декілька крапель суспензії (5) на поверхню покривного скельця, висушують

ішвидко проводять через полум’я пальника. На фіксований препа­ рат наливають протраву і залишають її на 10-15 хв. Протрава скла­ дається з насиченого спиртового розчину основного фуксину, 20 % водного розчину таніну й насиченої на холоді солі Мора (сірчанокис­ ле закисне аміачне залізо). Після цього препарат промивають дисти­ льованою водою і забарвлюють карболовим фуксином Ціля 2-5 хв. Препарат знову промивають водою, висушують і мікроскопують.

Методика фарбування включень у бактерій. За методом Нейссера для виявлення волютинових зерен у коринебактерій і, зокрема, в дифтерійних паличок, на фіксований препарат на 1-2 хв наносять краплю оцетовокислого метиленового синього (барвник Нейссера),

60

а потім розчин Люголя на 10-30 с. Промивають препарат водою та забарвлюють водним розчином везувіну або хризоїдину протягом 1 хв і знову промивають водою та висушують. Тіла бактеріальних клітин фарбуються в ніжно-жовтий колір, зерна волютину - в темно-синій (рис. 17, вкл.).

За методом Леффлера препарат фарбують протягом 10-30 с лужним метиленовим синім, промивають водою, висушують і мік­ роскопують. Гранули поліфосфатів виглядають як кульки синього або фіолетового кольору, а цитоплазма забарвлюється у світлоголубий (рис. 18, вкл.).

Методика виявлення ядерної субстанції. З цією метою використо­ вують метод Пікарського. Фіксований метиловим спиртом або су­ мішшю Нікіфорова препарат обробляють Ш розчином соляної кис­ лоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильо­ ваною водою, висушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбу­ ються в темно-червоний, а цитоплазма клітин - у рожевий колір.

Практична робота

1.Виготовити мазок із суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій (стафілококів і кишкових паличок) і забарвити за методом Грама.

2.Забарвити мазки з мокротиння хворого на туберкульоз за методом Ціля-Нільсена.

3.Готовий препарат з бактеріями, що мають волютинові зерна, забарвити за методами Нейссера і Леффлера.

4.Демонстрація мікроорганізмів, що утворюють спори і капсули.

Питання для самоконтролю

1.Сучасна класифікація й номенклатура бактерій.

2.Я кі сут т єві ознаки еукаріотів і прокаріотів?

3.Поділ кулястих і паличкоподібних бактерій за гх розташуванням

упрепаратах-мазках.

4.Патогенні для людини звизисті форми. Я кі захворювання вони викликають?

5.Ст рукт ура оболонки грампозитивних і грамнегативних клітин, їх нуклеоїду, цитоплазми та її включень. Методи виявлення ст рукт ур бактеріальної клітини.

6.Що таке протопласти, сферопласти, Ь-форми бактерій?

7.Капсули, спори, джгутики, спори бактерій, їх будова та методи виявлення.

61

8. Особливості будови актиноміцетів, спірохет , рикетсій, хламідій, мікоплазм, найпростіших та грубів. Захворювання, які еони викликають у людини.

Ситуаційні задачі

1.Після чотирьох етапів забарвлення за методом Грама в модифікації Синьова препарата з мікроорганізмів у мазку не видно ніяких бактерій. Як вони забарвляться за Грамом після п'ятого етапу?

2.При забарвленні за методом Ціля-Нільсена під мікроскопом видно синього кольору мікроорганізми. Як оцінити іх кислотостійкість?

3.Виберіть, які бакт ергі ут ворюют ь капсулу:

а) пневмококи; б) гонококи;

в) збудники сибірки; г) кишкова паличка; д) сальмонели.

Відповіді

1.Бактергі будут ь червоними, тобто грамнегативними.

2.Мікроорганізми кислотонестійкі.

3.А, в.

62

Розділ 3. ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.

Бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмно­ ження, продукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональної активності клі­ тин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовніш­ нього середовища.

Хімічний склад бактерій

Як і всі живі істоти, бактерійна клітина складається з чотирьох основних елементів - азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає 45-55 % сухого залишку клітини, кисень - 25-30 %, азот - 8-15 % і водень - 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з якого побу­ довано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.

Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. Вона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або зв’язаному стані. Вільна вода є середовищем, в якому відбувається розмаїття біохі­ мічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) внаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона виступає розчинником багатьох речовин, що надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.

Зв’язана вода - також необхідний компонет цитоплазми, проте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призво­ дить до її загибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає виходити з неї, цитоплазма зморщується, відшарову­ ється від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.

Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, вуглеводів, полісахаридів, низько­ молекулярних органічних речовин і солей.

Білок складає до 55 % сухого залишку клітини. Його представ­ лено простими та складними білками. Прості білки називають протеїнами. За своїм складом вони суттєво не відрізняються від

63

білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса міститься в цито­ плазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці грамнегативних мікробів, нуклеоїді. Токсини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза є простими білками.

Складні білки - протеїди свою назву отримали за здатність сполу­ чатися з іншими речовинами. Так, білки, зв’язані з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами - глікопротеїди, ліпідами - ліпопротеїди, залізом, міддю - хромопротеїди. Вони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нук­ леопротеїди забезпечують суперспіралізацію нуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й вико­ нують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; ліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бакте­ ріальних ендотоксинів, отже, вірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну функцію клітини, є переносниками кисню.

Тонкі фізико-хімічні дослідження дозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів.

Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою (ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. їх вміст коливається в межах 25-30 % сухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, транспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК - форма, що утворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної інформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. Рибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від РНК еукаріотів за константою седиментації. Транспортні РНК здатні зв’язуватись із амінокислотами, що накопичуються в цито­ плазмі, й доставляти їх до рибосом, на яких відбувається процес біосинтезу.

Вуглеводи становлять 12-20 % сухого залишку. їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, олігота поліозидами, полісахаридами, іншими сполуками. їх роль у забезпеченні життєдіяльності клітини важко переоцінити, так як вони входять до складу будь-яких структур клітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. Полісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони зумовлюють

64

антигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) властивості.

Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли в основу розробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. Особли­ вості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вак­ цини, специфічні діагностичні сироватки.

У клітині міститься в середньому до 10 %ліпідів. Однак в окремих груп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується до 40 %. У грамнегативних бактерій в зв’язку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 разів більше, ніж у грампозитивних.

В середньому в клітині є до 22 млн молекул різноманітних ліпідів. Представлено їх, в основному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних кислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні властивості клітини (кисло­ тостійкість), її токсичні функції, беруть участь у метаболізмі.

Важливою складовою частиною будь-якої мікробної клітини є міне­ ральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і можуть знаходитись у вільному стані в цитоплазмі. Без них не обхо­ дяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у мікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх похідні за рахунок здатності утворювати макроергічні (багаті на енергію) зв’язки постача­ ють клітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєді­ яльності бактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й кальцій здатні активувати багато ферментів; залізо - невід’ємний складник цитохромів.

Клітинний метаболізм

Сукупність усіх біохімічних перетворень у клітині називається мета­ болізмом. Він відбувається за двома основними напрямками. Перший забезпечує синтез складних клітинних сполук із більш простих. Тому він одержав назву біосинтез, конструктивний метаболізм або анабо­ лізм. Однак переважна більшість реакцій синтезу й розпаду потребує енергетичного забезпечення. Тому енергетичний метаболізм або ката­ болізм представляє собою потік реакцій, які супроводжуються накопи­ ченням електрохімічної енергії, що потім використовується клітиною.

Конструктивний та енергетичний метаболізм - тісно пов’язаний між собою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і

65

одні й ті ж речовини використовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи - амфіболічними.

Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. Вони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для побудови власних структур. Саме цим зумовлюється убіквітарність їх розповсюдження.

Конструктивний метаболіз прокаріотів. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись постійний обмін речовин з навко­ лишнім середовищем. У клітину ззовні мусить надходити пластичний матеріал, з якого вона синтезує всі необхідні їй молекули.

У конструктивному метаболізмі провідна роль належить сполу­ кам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. Залежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві гру­ пи: автотрофи і гетеротрофи.

Автотрофи (autos - сам, trophe - живлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з С02 як єдиного джерела вуглецю. Гетеротрофи (heteros - інший) - мікроорганізми, джерелом вуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні споживати будь-які прості й складні вуглецеві сполуки - цукри, амінокислоти, багатоатомні спирти, парафіни та ін.

Ступінь вираження гетеротрофії у бактерій може бути найрізно­ манітніша. Найвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити тільки всередині живих клітин (рикетсії, хламідії). їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі мікроорганізми називають облігатними (суворими) паразитами.

Однак багато мікробів можна вирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, пептиди, вітаміни, фраг­ менти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних рости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, назива­ ють факультативними паразитами.

Більшість бактерій, що населяють земну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих організмів не залежать і живляться за рахунок мертвих органічних залишків.

Мікроорганізмам необхідний азот для синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні бактерії здатні за­ своювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), інші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило, засвоюють азот у відновленій формі - це солі амонію, сечовини, органічні

66

сполуки (амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) також можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони відновлюються до аміаку за допомогою ферментів нітратредуктази й нітритредуктази.

Дикі штами бактерій здатні синтезувати всі необхідні їм речовини з обмеженого числа органічних сполук, наприклад, глюкози та солей амонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми (ва­ ріанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних їм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живиль­ них середовищах. їх називають ауксотрофними організмами.

Джерела енергії та донори електронів. Залежно від джерела енергії, що засвоюють мікробні клітини, їх поділяють на фототрофи і хсмотрофи.

Фототрофні бактерії здатні використовувати енергію сонячного світла. їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патоген­ них для людини серед них немає. Інші прокаріоти, які одержують енергію за рахунок окисно-відновних реакцій в субстратах, назива­ ються хемотрофами.

Для здійснення різноманітних реакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних перетворень віддають електро­ ни, називаються донорами. Молекули, які одержують електрони, називаються акцепторами.

Мікроорганізми, для яких джерелом електронів є неорганічні сполуки типу Н2, Н2Б, 1^Н3+, Ее +2 та інші, називаються літотрофами (Мов - камінь). Інші бактерії, для яких донором електронів виступають органічні речовини, називаються органотрофами.

Залежно від способу одержання енергії, донора електронів та дже­ рела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 основних типів прокаріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й фотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, хемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемоорганоавтотрофи й хемоорганогетеротрофи.

Мікроорганізми, які здатні викликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів.

Бактерії, яким притаманний один із спосібів живлення, позначають як облігатні, а ті, які використовують два джерела енергії, - міксотрофи.

Для здійснення своїх метаболічних перетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні сполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн),

67

вітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору неможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він необ­ хідний компонент фосфоліпідів, коферментів.

Мікроорганізми засвоюють сірку з природних джерел, де вона знаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної сірки, а потреби у фосфорі задовольняються за рахунок засвоєння неорганічних фосфатів.

Усі необхідні йони металів клітина одержує за рахунок неорганіч­ них сполук. Деякі елементи (магній, кальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в інших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у клітині надзви­ чайно різноманітна, так як вони входять до складу основних клітинних метаболітів, виконуючи життєво важливі функції.

При культивуванні бактерій крім білків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього середовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів росту. Вони включаються до складу клітинних метаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі вітаміни (біотин, тіамін, пантотенова кислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та піримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.

Надходження речовин у клітину. Незважаючи на досягнення мік­ робіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клі­ тині остаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення метаболітів назовні не з ’ясовано. Встановлено, що мікробам притаманний голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні речовини тільки в розчиненому вигляді.

Однак деякі субстрати не розчиняються у воді (білки, полісахари­ ди), або утворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому випадку клітинні екзоферменти, які виділяються в навко­ лишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплю­ ючи їх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.

Виділяють декілька механізмів проникнення речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли створюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та зовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії. Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків - пермеаз, які містяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає

68

енергетичного забезпечення. Однак більшість поживних речовин, метаболітів, іонів проникають у клітину за допомогою активного транспорту. Його також забезпечують білки-пермеази, але вони є високоспецифічними й здатні переносити тільки певні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує клітина, тому можливий перенос і проти градієнта концентрації речовини. Як­ що цьому процесу передує певна хімічна модифікація молекули, його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також меха­ нізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних іонів.

Конструктивний метаболізм. Обмін білків у мікроорганізмів відбу­ вається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до амінокислот і біосинтетичні процеси, пов’язані з конструюванням нових молекул. Перший напрямок забезпечують ферменти екзопротеази, що виділяються в навколишнє середовище, та ендопротеази, які нагромаджуються в клітині. Кінцеві продукти - амінокислоти, - що утворюються під час цього процесу, можуть зазнавати дезаміну­ вання та декарбоксилювання, перетворюючись на аміак, вуглекислий газ, оксикислоти.

Біосинтетичні процеси відбуваються за участю готових амінокис­ лот, які трансамінуються або переамінуються. Деякі мікроорганізми здатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно зазначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму люди­ ни, здатні синтезувати незамінні амінокислоти - лізин, метіонін, триптофан.

Вуглеводний обмін забезпечуєтся або гідролітичним розщеплен­ ням молекул з утворенням глюкози й мальтози або фосфоролізом. І в одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються вивіль­ ненням енергії. Це відбувається при бродінні - окисновідновних реак­ ціях анаеробного розщеплення органічних речовин, головним чином, вуглеводів. Метаболіти, які утворюються під час бродіння, використо­ вуються для біосинтетичних процесів. Продуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, мурашина), спирти (ети­ ловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, водень. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, розрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види бродіння. При бродінні вивільняється незначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 молекулу субстра­ ту утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).

69