Біоконверсія лігноцелюлозних об'єктів

Рослинна біомаса – поновлюване й легкодоступне джерело сировини. Основні її компоненти – целюлоза (²/₃), крохмаль, геміцелюлоза, лігнін. Лігнін – високомолекулярний нерозчинний тривимірний неупорядкований ароматичний полімер. Целюлоза – високомолекулярний нерозчинний полімер глюкози. Вона є головним компонентом як рослинної біомаси, так і сільськогосподарських, побутових відходів, а також відходів деревообробної й целюлозно-паперової промисловості.

В основі біологічної деградації лігноцелюлози лежить дія целюлолітичних ферментів. Реакційна здатність природних целюлозовмісних матеріалів невелика, тому сировина для ферментативного оцукрювання целюлози повинна мати велику поверхню, а мікрофібрилярна структура целюлози повинна бути зруйнована. Реакційну здатність природних субстратів також знижує наявність лігніну. Найбільш ефективним, а також дорогим й енергоємним способом попередньої підготовки сировини є розмел. Тому для передобробки використовують 0,5 – 2% розчини лугів, γ-опромінення, механо-термообробку в розведеній сірчаній кислоті з наступною екстракцією лігніну й ін. методи.

Гідроліз можна проводити й біологічним способом, за допомогою ферментів, які виділяються грибами видів Trichoderma, Aspergillus, Sporotrichum. Далі при використанні дріжджів можна одержати спирт, при використанні бактерій Klebsiella або Aeromonas – бутанол. Ряд мікроорганізмів роду Clostridium можуть продукувати оцтову й молочну кислоти, лактат, ацетон із соломи, відходів цукрового очерету. За допомогою Trichoderma reesii біомаса розкладається до вуглеводів.

Ферменти й целюлоза, що не розклалася, надходять у повторні цикли, а залишковий лігнін використовується як джерело енергії для перегонки спирту. Технологія, розроблена в Арканзасському університеті й використовується в промисловості нафтовою компанією «Галфойл», полягає в одночасному оцукрюванні целюлози й зброджуванні вуглеводів, отриманих шляхом гідролізу. Для цього до суміші целюлозної біомаси й дріжджів додають розчин целюлаз. Лігнін, що залишається, також використовується для перегонки як паливо, але пентози не зброджуються.

Третій вид технології складається в прямому зброджуванні целюлозними бактеріями гексоз і пентоз, які утворюються при гідролізі целюлози й геміцелюлози. Переваги цієї технології, розробленої в лабораторіях Массачусетського технологічного інституту, полягають у наступному: крім одночасної конверсії целюлози і пентози в етанол відбувається комбінація целюлозного й спиртового бродіння, а, крім того, необхідна попередня обробка субстратів зводиться до мінімуму.

При мікробній деградації й конверсії целюлози і геміцелюлози можна одержувати етиловий спирт і сировину для хімічної промисловості (фурфурол, феноли, крезоли). 200 000 т належним чином переробленої соломи дають 50 000 т етанолу й 20 000 т фурфуролу. За оцінками деяких фахівців, при мікробній переробці целюлози можна одержати до 30% нафтохімікатів. Методи генної інженерії допоможуть створити штами, які будуть краще адаптовані до цих типів конверсії й дадуть більший вихід. Це дозволить розробити реальну стратегію заміщення, яка стане ефективною (хімія карбону прийде на зміну нафтохімії при виробництві нових біополімерів, біорозчинників і біодетергентів). Перенесення генів целюлаз і геміцелюлаз із Clostridium thermocellum в інші види Clostridium дозволить перетворювати целюлозу й геміцелюлозу в етиловий спирт, ацетон, бутанол, оцтову й молочну кислоти.

Термофілія певних штамів Clostridium (при оптимальній температурі росту 65 – 75°С) створює переваги, тому що вартість перегонки етилового спирту й інших розчинників зменшиться, а це зробить виробничий процес більше економічним.

Дослідники з Університету Нового Південного Уельсу (Австралія) і Рутгерського університету (США) виявили, що бактерія Zymomonas mobilis, яка виділена з пальмового вина й мексиканського алкогольного напою пульке, зброджує вуглеводи у два рази швидше, ніж дріжджі. Цей вид також піддається геномній модифікації, що дозволить розкладати целюлозу з одночасним зброджуванням вуглеводів, які утворюються в ході деградації.

В умовах суворого анаеробіозу можна здійснювати біометаногенез ароматичних сполук. Цей процес, широко розповсюджений у природі, особливо у відходах і стічних водах, а також при конверсії деяких біоцидів. За спостереженнями Феррі й Вольфа, у цьому процесі беруть участь кілька видів мікробів, відповідальних за різні стадії деградації ароматичних кілець до ацетату, який є одним із субстратів для метанобактерій (іншими словами, його дегідрування дає електрони, які потрібні для відновлення двоокису карбону в метан). Серед бактерій видів превалюють, зважаючи на все, Methanobacterium formicicum й Methanospirillum hungati. Феррі й Вольфу вдалося їх вивести в чисті культури.

Бензольне кільце спочатку відновлюється й потім розрізається на аліфатичні кислоти під дією грамнегативних мікроорганізмів. Останні перетворюються в субстрати, які використовують метанобактерії. Електрони, які утворюються, імовірно, сприяють утворенню водню, який відновлює С₂ у СН₄.

Перетворення бензольного кільця в метан у процесі анаеробіозу не є правилом. Наприклад, у рубці жуйних тварин бензоат й ароматичні кислоти, які утворюються в результаті деградації целюлози, не призводять до утворення метану; їх можна виявити в сечі у вигляді гіпуратів та інших подібних сполук. У природних умовах ароматичні сполуки утворюються при повільному розкладанні танінів і лігніну головним чином завдяки позаклітинним мікробним ферментам.

Оскільки лігніни й таніни складають значну частину ґрунтового органічного матеріалу, метаногенез цих полімерів – важливий процес у вуглецевому циклі біосфери.

Одним із відходів сільського господарства є солома. Ці відходи важко використати, тому що швидкість розкладання соломи невелика. Найкращою є утилізація – інокулювання її з асоціацією целюлолітичних грибів, азотфіксуючих і полісахаридутворюючих бактерій. У такому вигляді солому можна заорювати в землю як органічне добриво, а можна через певний час використати як высокобілковий вітамінізований корм.

Лекція № 3. Об'єкти біотехнології та їх біотехнологічні функції

1. Бактерії й ціанобактерії.

2. Гриби.

3. Найпростіші.

4. Водорості.

5. Рослини.

Біотехнологічні об'єкти знаходяться на різних щаблях організації:

а) субклітинні структури (віруси, плазміди, ДНК мітохондрій і хлоропластів, ядерна ДНК); б) бактерії й ціанобактерії; в) гриби; г) водорості; д) найпростіші; е) культури клітин рослин і тварин; ж) рослини – нижчі (анабена-азолла) і вищі – ряскові.

Бактерії й ціанобактерії

Мікроорганізмів, які синтезують продукти або здійснюють реакції, корисні для людини, кілька сотень видів. Біотехнологічні функції бактерій різноманітні. Бактерії використовуються при виробництві: – харчових продуктів, наприклад, оцту (Gluconobacter suboxidans), молочнокислих напоїв (Lactobacillus, Leuconostoc) і ін.; – мікробних інсектицидів (Bacillus thuringiensis); – білка (Methylomonas); – вітамінів (Clostridium – рибофлавін); – розчинників й органічних кислот; – біогазу й фотоводню.

Корисні бактерії відносяться до еубактерій. Оцтовокислі бактерії, представлені родами Gluconobacter й Acetobacter, – це грамнегативні бактерії, які перетворюють етанол в оцтову кислоту, а оцтову кислоту у вуглекислий газ і воду. Рід Bacillus відноситься до грампозитивних бактерій, які здатні утворювати ендоспори й мають перитрихіальні джгутики. B.subtilis – суворий аероб, а B.thuringiensis може жити й в анаеробних умовах. Анаеробні бактерії, які утворюють спори представлені родом Clostridium. C.acetobutylicum зброджують вуглеводи в ацетон, етанол, ізопропанол й n-бутанол (ацетобутанолове бродіння), інші види можуть також зброджувати крохмаль, пектин і різні азотвмісні сполуки.

До молочнокислих бактерій відносяться представники родів Lactobacillus, Leuconostoc й Streptococcus, які не утворюють спори, грампозитивні й нечутливі до кисню. Гетероферментативні молочнокислі бактерії роду Leuconostoc перетворюють вуглеводи в молочну кислоту, етанол і вуглекислий газ. Гомоферментативні молочнокислі бактерії роду Streptococcus продукують тільки молочну кислоту, а бродіння, яке здійснюють представники роду Lactobacillus, дозволяє одержати поряд з молочною кислотою ряд різноманітних продуктів.

До бактерій роду Corynebacterium, нерухомі грампозитивні клітини які не утворюють ендоспор, відносяться патогенні (C.diphtheriae, C.tuberculosis) і непатогенні ґрунтові види, що мають промислове значення. С.glutamicum є джерелом лізину і поліпшує смак нуклеотидів. Коринебактерії хоча й вважаються факультативними анаеробами, краще ростуть аэробно. Бактерії використовуються для мікробного вилужування руд й утилізації гірничорудних відходів.

Широко використовується така властивість деяких бактерій, як діазотрофність, тобто здатність до фіксації атмосферного азоту.

Виділяють дві найбільші групи діазотрофів:

– симбіонти: без кореневих клубеньків (азотобактер – лишайники, азоспіриллум – лишайники, анабена – лишайники, азолла), з кореневим клубеньками (бобові – ризобії, вільха, лох, обліпиха – актиноміцети);

– вільноживучі: гетеротрофи (азотобактер, клостридіум, метилобактер), автотрофи (хлоробіум, родоспіриллум й амебобактер).

Мікробні клітини використовують для трансформації речовин.

Бактерії також широко використовуються в генноінженерних маніпуляціях при створенні геномних клонотек, введенні генів у рослинні клітини (агробактерії).

Виробничі штами мікроорганізмів повинні відповідати певним вимогам: здатність до росту на дешевих поживних середовищах, висока швидкість росту й утворення цільового продукту, мінімальне утворення побічних продуктів, стабільність продуцента відносно виробничих властивостей, нешкідливість продуцента й цільового продукту для людини й навколишнього середовища. У зв'язку із цим всі мікроорганізми, які використовуються в промисловості проходять тривалі випробування на нешкідливість для людей, тварин і навколишнього середовища. Важливою властивістю продуцента є стійкість до інфекції, що важливо для підтримки стерильності, і фагостійкість.

Усі ціанобактерії володіють здатністю до азотфіксації, що робить їх досить перспективними продуцентами білка. Анабена (Anabaena) – нитчаста (синьо-зелені водорості). Нитки з більш-менш округлих клітин, містять гетероцисти й іноді великі спори, по всій довжині нитки однакової товщини. У цитоплазмі клітин відкладається подібний до глікогену запасний продукт – анабенін. Такі представники ціанобактерій, як носток, спіруліна, триходесміум їстівні й безпосередньо вживаються в їжу. Носток утворює на безплідних землях скоринки, які розбухають при зволоженні. У Японії місцеве населення використовує в їжу шари ностока, які утворюються на схилах вулканів й називає їх ячмінним хлібом Тенгу (Тенгу – добрий гірський дух).

Свій хід спіруліна (Spirulina platensis) почала з Африки – населення району озера Чад давно вживає її в їжу, називаючи цей продукт «дихе». Інше місце, звідки почала поширюватися спіруліна, але іншого виду (Spirulina maxima) – води озера Тескоко в Мексиці. Ще ацтеки збирали з поверхні озер й уживали в їжу слизову масу синьо-зеленої водорості спіруліни. Уперше галети "текуітлатл" згадані іспанцем Кастильо у 1521 р. Ці галети продавалися на базарі в Мехіко й складалися з висушених шарів S.maxima. У 1964 році бельгійський ботанік Ж.Леонар звернув увагу на галети синьо-зеленого кольору, які місцеве населення виготовляло з водоростей, що ростуть у лужних ставках навколо озера Чад. Ці галети являли собою висушену масу спіруліни. Аналіз зразків Spirulina показав, що в ній мітиться 65% білків (більше, ніж у соєвих бобах), 19% вуглеводів, 6% пігментів, 4% ліпідів, 3% волокон й 3% золи. Для білків цієї водорості характерним є збалансований вміст амінокислот. Клітинна стінка цієї водорості добре переварюється. Як озеро Тескоко, так і водойми району озера Чад мають у воді дуже високі концентрації лугів. Характерно, що в таких озерах спіруліна повністю домінує й росте майже як монокультура – становить в окремих озерах до 99 % загальної кількості водоростей. Росте спіруліна в лужному середовищі при рН аж до 11. Її збирають також з озер біля м. Мехіко, одержуючи до 2 т сухої маси біомаси водорості на добу, і ця продукція розсилається в США, Японію, Канаду. В інших країнах спіруліну культивують в штучних водоймах або спеціальних ємностях. Спіруліну можна культивувати у відкритих ставках або, як в Італії, у замкнутій системі з поліетиленових труб. Урожайність дуже висока: одержують до 20 м сухої маси водорості з 1 м² у день, а розрахунки на рік показали, що вона перевищить вихід пшениці приблизно в 10 разів.

Переваги спіруліни в порівнянні з іншими їстівними водоростями не тільки в простоті культивування, але й у нескладності збору біомаси, висушування її, наприклад, під сонцем. У ряді країн вирощують спіруліну виду Spirulina platensis. Недавно було показано, що в клітинах спіруліни, окрім білка, вуглеводів, ліпідів, вітамінів, у значних кількостях запасається, наприклад, така речовина, як полі-b-оксибутират. Вітчизняна фармацевтична промисловість випускає препарат «Сплат» на основі ціанобактерії Spirulina platensis. Він містить комплекс вітамінів і мікроелементів і застосовується як загальзміцнюючий та імуностимулюючий засіб.