Іммобілізація ферментів

Ферменти – речовини білкової природи й тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів і продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено у 1916 році, коли Дж. Нельсон й Е. Гриффін адсорбували на вугіллі інвертазу й показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін "іммобілізовані ферменти узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження волі пересування білкових молекул у просторі.

Сутність іммобілізації ферментів – прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основи або виведення на напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбційно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (у капсулу й т.п.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, які не входять в активний центр ферменту й не беруть участі в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожніх волокон, трубочок, капсул і т.д. Має значення розмір часток носія. Важливо мати велику площу поверхні, тому рекомендуються невеликі частки діаметром 0,1 – 0,2 мм. Носієм ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.

Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

1. Гетерогенний каталізатор легко відокремлюється від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використати фермент повторно, а також одержувати чистий від ферменту продукт.

2. Ферментативний процес із використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безупинно, регулюючи швидкість каталізуємої реакції й вихід продукту.

3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо відносно макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу й інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло й звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньо-молекулярної або міжмолекулярної зшивки білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.

Класифікація носіїв для ферментів

Для одержання іммобілізованих ферментів використовується обмежене число як органічних, так і неорганічних носіїв. Вони повинні володіти такими властивостями (Дж. Порат, 1974): висока хімічна й біологічна стійкість; висока хімічна міцність; достатня проникність для ферменту й субстратів, пористість, велика питома поверхня; можливість одержання у вигляді зручних у технологічному відношенні форм (гранул, мембран); легка активація; висока гідрофільність; невисока вартість.

Носії поділяють на дві групи: органічні, до складу яких входять низькомолекулярні й полімерні та неорганічні: макропористі та інші.

Слід зазначити, що органічні носії (як низько-, так і високомолекулярні) можуть бути природного або синтетичного походження. Природні полімерні органічні носії ділять відповідно до їхньої біохімічної класифікації на 3 групи: полісахаридні, білкові й ліпідні.

Синтетичні полімери також можна розділити на групи у зв'язку з хімічною будовою основного ланцюга макромолекул: поліметиленові, поліамідні, поліефірні.

Для іммобілізації ферментів найбільш широко використовуються природні полісахариди й синтетичні носії поліметильного типу, інші застосовуються значно рідше. Велике значення природних полімерів як носіїв для іммобілізації залежить від їх доступності й наявності реакційно-здатних функціональних груп, які легко вступають у хімічні реакції. Характерною рисою цієї групи носіїв також є їх висока гідрофільність. Недолік природних полімерів – нестійкість до впливу мікроорганізмів і досить висока вартість.

Найбільш часто для іммобілізації використовуються такі полісахариди, як целюлоза, декстран, агароза і їхні похідні. Целюлоза гідрофільна, має багато гідроксильних груп, що дозволяє модифікувати її, заміщаючи ці групи. Для збільшення механічної міцності целюлозу гранулюють шляхом часткового гідролізу, у результаті якого руйнуються аморфні ділянки. На їхнє місце для збереження пористості між кристалічними ділянками вводять хімічні зшивки. Гранульовану целюлозу досить легко перетворити в різні іонообмінні похідні, такі як ДЕАЕ-целлюлоза, КМЦ і т.д.

Широко поширені носії на основі декстрану, що випускаються під назвою "сефадекси". При висушуванні вони легко стискуються, у водному розчині сильно набухають. У цих носіях розмір пор у гелі регулюється ступенем зшивання. До групи декстранів відносять і крохмаль. Хімічно модифікований крохмаль зшивається агентами, такими як формальдегід. Таким способом був отриманий губчатий крохмаль, який володіє підвищеною стійкістю стосовно ферментів, гідролізу. Водорозчинні препарати на основі декстрану часто застосовуються як носії лікарських засобів у медицині.

Гарним носієм уважається агар. Його властивості поліпшуються після хімічної зшивки, наприклад, діепоксидними сполуками. Такий агар стає стійким до нагрівання, міцний, легко модифікується.

Білки як носії володіють рядом достоїнств: місткі, здатні до біодеградації, можуть застосовуватися в якості тонкої (товщиною 80 мкм) мембрани. Іммобілізацію ферментів на білкових носіях можна проводити як під час відсутності, так й у присутності зшиваючих агентів. Білки використовуються й у фундаментальних біологічних дослідженнях, і в медицині. До недоліків білків як носіїв відносять їх високу імуногенність (за винятком колагену й фібрину). Найбільше для іммобілізації використовуються структурні (кератин, фібрин, колаген), рухові (міозин) і транспортні (альбумін) білки.

Синтетичні полімерні носії застосовуються для ковалентної й сорбційної іммобілізації ферментів, для одержання гелів, мікрокапсул. Полімери на основі стиролу застосовуються при сорбційній іммобілізації. Вони можуть мати макропористу, ізопористу структуру, а також гетеропористу структуру. Для одержання полімерних гідрофільних носіїв широко використовується акриламід – похідне акрилової кислоти.

Широке поширення одержав метод включення ферментів і клітин у поліакриламідний гель, який має тверду просторову сітчасту структуру. Поліакриламідний гель стійкий до хімічних впливів. Дуже цікаву групу представляють поліамідні носії. Це групи різних гетероланцюгових полімерів з повторюваною амідною групою –С(ОН)–NH–. Наприклад, полімери на основі N–вінілпіролідону використовуються для одержання іммобілізованих ферментів, здатних повільно розпадатися в організмі. Крім того, вони біологічно інертні, що особливо важливо при використанні в медичних цілях. Істотним недоліком більшості полімерних носіїв є їхня здатність накопичуватися в організмі. Щодо цього перевага віддається природним полімерам, які гідролізуються ферментами. Тому до складу лікарських препаратів часто входить декстран, а із синтетичних носіїв – полімери на основі N–вінілпіролідону. У цей час ведуться експерименти по створенню синтетичних полімерів, які розщеплюються з утворенням нетоксичних продуктів обміну.