- •Лекція № 1. Основні напрями розвитку біотехнології
- •Біоенергетика
- •Біотехнологія обробки стоків і контроль забруднення води важкими металами
- •Сільськогосподарська біотехнологія
- •Біогеотехнологія
- •Біоелектроніка
- •Біотехнологія в медицині
- •Біотехнології в харчовій промисловості
- •Біотехнологія молочних продуктів
- •Виробництво спиртів і поліолів
- •Виробництво вторинних метаболітів
- •Біотрансформація
- •Виробництво ферментів
- •Виробництво амінокислот, органічних кислот, вітамінів
- •Біоконверсія лігноцелюлозних об'єктів
- •Використання грибів у біотехнології
- •Найпростіші в біотехнології
- •Водорості
- •Рослини в біотехнології
- •Стадії біотехнологічного виробництва
- •Технологія виготовлення поживного середовища для біосинтезу
- •Підтримка чистоти культури
- •Ферментація, будова ферментера
- •Загальні принципи розділення речовин
- •Одержання готових товарних форм препаратів
- •Субстрати для культивування мікроорганізмів з метою одержання білка
- •Лекція № 6. Технологія одержання мікробних ліпідів
- •Мікроорганізми – продуценти ліпідів
- •Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів
- •Глибинний метод виробництва ферментів
- •Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
- •Іммобілізація ферментів
- •Класифікація носіїв для ферментів
- •Методи іммобілізації ферментів
- •Застосування іммобілізованих ферментів
- •Іммобілізація клітин
- •Ентомопатогенні препарати грибів
- •Вірусні ентомопатогенні препарати
- •Бактеріальні добрива на основі бульбочкових бактерій
- •Виробництво азотобактерину
- •Бактеріальне добриво фосфобактерин
- •Антибіотики для сільського господарства
- •Лекція № 9. Культура клітин рослин
- •Сфери застосування культур рослинних клітин
- •Культури клітин вищих рослин. Історія методу
- •Морфофізіологічні характеристика каллусних тканин
- •Фактори, що впливають на морфогенез in vitro
- •Генетичні механізми, що обумовлюють диференціювання клітин у культурі
- •Суспензійні культури
- •Методики культивування одиночних рослинних клітин
- •Необхідність іммобілізації рослинних клітин, методи
- •Фізіологічні основи переваги іммобілізованих рослинних клітин перед традиційними способами культивування
- •1. Клітини, іммобілізовані в або на інертному субстраті, утворюють біомасу набагато повільніше, ніж зростаючі в рідких суспензійних культурах.
- •2. Крім повільного росту іммобілізація клітин дозволяє їм рости в тісному фізичному контакті одине з одним, що сприятливо позначається на хімічних контактах.
- •Системи культивування іммобілізованих клітин
- •Застосування ізольованих протопластів
- •Способи отримання і культивування протопластів
- •Способи культивування протопластів
- •Злиття протопластів (парасексуальная гібридизація)
- •Види соматичних гібридів
- •Конструювання клітин
- •Клітинна селекція. Методи клітинної селекції
- •Генетичні основи застосування культури клітин в селекційних цілях
- •Типи клітинних культур, які використовуються в селекції
- •Переваги клітинної селекції перед традиційними селекційними методами
- •Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин
- •Фактори, впливають на процес клонального мікророзмноження
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Методи клонального мікророзмноження
- •Оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів методами хіміотерапії і термотерапії
- •Створення штучних асоціацій клітин вищих рослин
- •Підвищення продуктивності сільськогосподарських рослин
- •Ендосимбіотичні асоціації
- •Екзосимбіотичні асоціації з водоростями, грибами, азотфіксаторами
- •Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту
- •Безклітинні системи в біотехнології. Мембрани хлоропластів
- •Одержання фотогальванічних елементів з використанням бактеріальних мембран
- •Безклітинні білоксинтезуючі системи (ббсс)
- •Лекція № 10. Біотехнологія одержання культури тваринних клітин і тканин
- •Культивування клітин. Історія методу
- •Введення клітин у культуру, їхнє походження
- •Характеристика клітин, що культивуються in vitro
- •Поживні середовища й умови культивування
- •Системи культивування клітин
- •Використання культури клітин людини
- •Культивування клітин і тканин безхребетних
- •Культивування органів
- •Гібридизація тваринних клітин. Історія методу
- •Методи створення експериментальних химер
- •1. Агрегаційний – був запропонований практично одночасно й незалежно один від одного Тарковським у Варшаві та Мінц у Філадельфії (1961-1962 р.).
- •2. Ін’єкційний – був розроблений р. Гарднером у 1968 р.
- •Механізм злиття клітин
- •Моноклональні антитіла. Функціональна структура антитіл
- •Одержання моноклональних антитіл
- •Методи аналізу: імуноферментний (іфа), імунолюмінесцентний, імунорадіологічний
- •Радіоактивні мітки
- •Застосування моноклональних антитіл
- •Клонування тваринних клітин. Історія клонування
- •Методи трансплантації ядер
- •Клонування ссавців. Історія клонування
- •Регулювання відтворення сільськогосподарських тварин
- •Суперовуляція
- •Аеробне очищення стічних вод
- •Анаеробні системи очищення
- •Показники забруднення стічних вод
- •Перелік питань які виносяться на підсумковий контроль
- •Література
Механізм злиття клітин
Для індукції злиття клітин використовуються речовини різної природи. Іони Са2+, поліетиленгліколь, лізолецитин, моноолеат гліцерину, вірус Сендай.
Лізолецитин – поверхнево-активна речовина ліпідної природи, продукт деградації лецитину шляхом обробки останнього фосфоліпазою А. Лізолецитин пошкоджує мембрани й токсичний для живих систем. Цитотоксичний ефект цієї речовини можна зменшити знижуючи його концентрацію або додаючи під час обробки альбумін.
Моноолеат гліцерину також сполука ліпідної природи, але її ушкоджуюча дія менш виражена, а частота злиття клітин при застосуванні цієї речовини зростає в 4 – 7 разів у порівнянні зі спонтанним процесом. До інших аглютинуючих агентів, здатність яких викликати злиття клітин, була досліджена спеціально, відносяться лектини рослин й антитіла.
Перевага вірусу Сендай як агрегуючого агенту, полягає в повній відсутності цитотоксичного ефекту. Вірус перед уживанням інактивують, опромінюючи ультрафіолетовою лампою протягом 5 хвилин, при цьому він втрачає здатність до розмноження, але зберігає здатність зливати клітини. Вірус Сендей має два недоліки:
– необхідність нарощувати, титрувати, концентрувати й інактивувати вірус;
– клітини рослин і грибів не мають рецепторів до цього вірусу, тому він не застосовується для їхньої гібридизації.
Перший етап злиття (рис. 6) – зближення мембран сусідніх клітин і встановлення між ними тісного контакту. Мембрани повинні бути наближені один до одного на відстані у декілька ангстрем так, щоб між ними були можливі взаємодії, подібні до гідрофобних зв’язків. Викликають подібне зближення агенти, які індукують аглютинацію клітин. Міксовіруси, наприклад, вірус Сендай, поряд з іншими вірусами, які не викликають злиття, насамперед викликають аглютинацію клітин, тобто досить тісне їхнє зближення, необхідне для успішного наступного злиття.
Поліетиленгліколь (ПЕГ) також викликає агрегацію клітин, хоча механізм дії його невідомий. Можливо, завдяки тому, що у водному розчині ПЕГ несе невеликий негативний заряд, молекули цього розміру досить великі, щоб між клітинами виникали електростатичні зв’язки. Підтвердженням цієї гіпотези є посилення аглютинації клітин, що викликається ПЕГ: двовалентні іони, очевидно, утворюють містки між ПЕГ і негативно зарядженими вуглеводами, що перебувають на клітинній поверхні. Відповідно до іншої гіпотези, протопласти зливаються в результаті дегідратації. Поглинання води індукує утворення пор на поверхні мембрани й відбувається перетікання внутрішньоклітинного матеріалу. Після злиття ділянки з порами зберігаються якийсь час. Існує два припущення, що пояснюють виникнення пор :
1. При високій концентрації ПЕГ (20 – 30%) вся вільна вода поглинається ним, викликаючи розриви в мембрані;
2. ПЕГ зменшує полярність води, що викликає перерозподіл полярних і гідрофобних компонентів мембрани, що стабілізують ліпідні шари.
З особливим успіхом для цих цілей використовується ПЕГ з молекулярною масою від 1500 до 7500.
Рис. 6. Етапи злиття клітин (за Н. Рінгертцом, Р. Севіджу, 1979): А – 1-й етап, зближення цитоплазматичних мембран: 1 – глікопротеїди, 2 – ліпіди, 3 – плазматичні мембрани, 4 – мітохондрії, 5 – мікрофіламенти, 6 – частки вірусу Сендай; Б – 2-й етап, вихід глікопротеїдів й оголення ліпідних шарів мембрани; В – 3-й етап, утворення міцел; Г – початок 4-го етапу, злиття мембран, утворення цитоплазматичних містків.
Лектини й антитіла – двох- або полівалентні сполуки, і їхня аглютинуюча функція пов’язана зі здатністю однієї молекули якого-небудь із цих сполук взаємодіяти з рецепторами, що перебувають на поверхні двох клітин, що й приводить до утворення зв’язку між клітинами. Достатня кількість таких молекулярних зв’язків може втримувати клітини разом, перешкоджаючи їхньому розходженню або в результаті броунівського руху, або в результаті електростатичного відштовхування, або в результаті активної міграції клітин.
На другому етапі глікопротеїди, розташовані на поверхні, починають вивільнятися з ділянок мембрани, що лежать між віріонами, і притягуються до місць прикріплення вірусних часток. Вуглеводні компоненти – найменш вивчена частина клітинної поверхні. У мембранах вони зустрічаються у вигляді нейтральних цукрів, а також ковалентно зв’язуються з ліпідами або білками. Саме в такому вигляді вони беруть активну участь у багатьох біологічних процесах. Встановлено, що глікопротеїди визначають антигенну специфічність клітин, несуть негативний заряд, характерний для клітин при фізіологічно нейтральних рН, беруть участь у розпізнаванні й адгезії клітин, визначають рецепторні ділянки для вірусів, бактерій, аглютинуючих агентів, беруть участь у процесі регуляції проникності мембран для іонів. Ці властивості й визначають їхню участь у злитті клітин.
Вуглеводи перешкоджають злиттю клітин, тому що розділяють ліпідні шари мембран, не даючи їм стикатися, тому що на поверхні нормальної клітини рецепторні ділянки розташовані рідко або поодинці. У результаті трансформації вірусом відбувається їхнє об’єднання в групи. Глікопротеїди мігрують у мембрані до місця адсорбції вірусу, залишаючи вільними сусідні ділянки, де й відбувається злиття клітин. У деяких випадках у видаленні вуглеводних груп, які перешкоджають злиттю клітин, беруть участь лізосомні ферменти. При цьому відбувається з’єднання лізосом або пухирців АГ із плазматичною мембраною, і локальне вивільнення глікозидаз. Така лізосомна активність може бути запрограмована (у гаметах, міобластах, макрофагах, тобто клітинах, що зливаються в природних умовах) або викликана експериментально при індукованому злитті клітин.
Третій етап – міцелізація оголених ліпідів двох протилежних мембран. Міцели – ліпідні краплі, де молекули ліпідів гідрофільними голівками обернені до води, а гідрофобні “хвости” жирних кислот заховані всередину. Цей процес підсилюється при високих значеннях рН і високій концентрації іонів кальцію. В обох клітинах починається ендоцитоз вірусних часток.
Четвертий етап – злиття мембран. Завдяки місткам, утвореним Са2+, розмір міцел зменшується. Під дією АТФ і Са2+, активізуються мікрофіламенти. Виниклий цитоплазматичний місток стабілізується й розширюється завдяки функціонуванню мікрофіламентів. На останніх етапах злиття клітин важливу роль відіграє наявність АТФ. АТФ утворюється завдяки діяльності мітохондрій. Полікаріони, що утворюються при злитті двох або трьох клітин, являють собою не безформні роздуті або дволопатеві кулі цитоплазми, а приймають форму, характерну для однієї з батьківських клітин або проміжну між ними. Форму клітини визначають мікротрубочки й мікрофіламенти. У процесі злиття клітин мікрофіламенти актиноміозинового типу, розташовані під цитоплазматичною мембраною, беруть безпосередню участь, тому що забезпечують з’єднання цитоплазм клітин, що злилися, і стабілізацію новоутвореної системи. Однак, формування цитоскелету – енергозалежний процес, який вимагає великої кількості АТФ. Напевно, цим обумовлена присутність мітохондрій у місцях злиття клітинних мембран.