- •Лекція № 1. Основні напрями розвитку біотехнології
- •Біоенергетика
- •Біотехнологія обробки стоків і контроль забруднення води важкими металами
- •Сільськогосподарська біотехнологія
- •Біогеотехнологія
- •Біоелектроніка
- •Біотехнологія в медицині
- •Біотехнології в харчовій промисловості
- •Біотехнологія молочних продуктів
- •Виробництво спиртів і поліолів
- •Виробництво вторинних метаболітів
- •Біотрансформація
- •Виробництво ферментів
- •Виробництво амінокислот, органічних кислот, вітамінів
- •Біоконверсія лігноцелюлозних об'єктів
- •Використання грибів у біотехнології
- •Найпростіші в біотехнології
- •Водорості
- •Рослини в біотехнології
- •Стадії біотехнологічного виробництва
- •Технологія виготовлення поживного середовища для біосинтезу
- •Підтримка чистоти культури
- •Ферментація, будова ферментера
- •Загальні принципи розділення речовин
- •Одержання готових товарних форм препаратів
- •Субстрати для культивування мікроорганізмів з метою одержання білка
- •Лекція № 6. Технологія одержання мікробних ліпідів
- •Мікроорганізми – продуценти ліпідів
- •Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів
- •Глибинний метод виробництва ферментів
- •Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
- •Іммобілізація ферментів
- •Класифікація носіїв для ферментів
- •Методи іммобілізації ферментів
- •Застосування іммобілізованих ферментів
- •Іммобілізація клітин
- •Ентомопатогенні препарати грибів
- •Вірусні ентомопатогенні препарати
- •Бактеріальні добрива на основі бульбочкових бактерій
- •Виробництво азотобактерину
- •Бактеріальне добриво фосфобактерин
- •Антибіотики для сільського господарства
- •Лекція № 9. Культура клітин рослин
- •Сфери застосування культур рослинних клітин
- •Культури клітин вищих рослин. Історія методу
- •Морфофізіологічні характеристика каллусних тканин
- •Фактори, що впливають на морфогенез in vitro
- •Генетичні механізми, що обумовлюють диференціювання клітин у культурі
- •Суспензійні культури
- •Методики культивування одиночних рослинних клітин
- •Необхідність іммобілізації рослинних клітин, методи
- •Фізіологічні основи переваги іммобілізованих рослинних клітин перед традиційними способами культивування
- •1. Клітини, іммобілізовані в або на інертному субстраті, утворюють біомасу набагато повільніше, ніж зростаючі в рідких суспензійних культурах.
- •2. Крім повільного росту іммобілізація клітин дозволяє їм рости в тісному фізичному контакті одине з одним, що сприятливо позначається на хімічних контактах.
- •Системи культивування іммобілізованих клітин
- •Застосування ізольованих протопластів
- •Способи отримання і культивування протопластів
- •Способи культивування протопластів
- •Злиття протопластів (парасексуальная гібридизація)
- •Види соматичних гібридів
- •Конструювання клітин
- •Клітинна селекція. Методи клітинної селекції
- •Генетичні основи застосування культури клітин в селекційних цілях
- •Типи клітинних культур, які використовуються в селекції
- •Переваги клітинної селекції перед традиційними селекційними методами
- •Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин
- •Фактори, впливають на процес клонального мікророзмноження
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Методи клонального мікророзмноження
- •Оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів методами хіміотерапії і термотерапії
- •Створення штучних асоціацій клітин вищих рослин
- •Підвищення продуктивності сільськогосподарських рослин
- •Ендосимбіотичні асоціації
- •Екзосимбіотичні асоціації з водоростями, грибами, азотфіксаторами
- •Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту
- •Безклітинні системи в біотехнології. Мембрани хлоропластів
- •Одержання фотогальванічних елементів з використанням бактеріальних мембран
- •Безклітинні білоксинтезуючі системи (ббсс)
- •Лекція № 10. Біотехнологія одержання культури тваринних клітин і тканин
- •Культивування клітин. Історія методу
- •Введення клітин у культуру, їхнє походження
- •Характеристика клітин, що культивуються in vitro
- •Поживні середовища й умови культивування
- •Системи культивування клітин
- •Використання культури клітин людини
- •Культивування клітин і тканин безхребетних
- •Культивування органів
- •Гібридизація тваринних клітин. Історія методу
- •Методи створення експериментальних химер
- •1. Агрегаційний – був запропонований практично одночасно й незалежно один від одного Тарковським у Варшаві та Мінц у Філадельфії (1961-1962 р.).
- •2. Ін’єкційний – був розроблений р. Гарднером у 1968 р.
- •Механізм злиття клітин
- •Моноклональні антитіла. Функціональна структура антитіл
- •Одержання моноклональних антитіл
- •Методи аналізу: імуноферментний (іфа), імунолюмінесцентний, імунорадіологічний
- •Радіоактивні мітки
- •Застосування моноклональних антитіл
- •Клонування тваринних клітин. Історія клонування
- •Методи трансплантації ядер
- •Клонування ссавців. Історія клонування
- •Регулювання відтворення сільськогосподарських тварин
- •Суперовуляція
- •Аеробне очищення стічних вод
- •Анаеробні системи очищення
- •Показники забруднення стічних вод
- •Перелік питань які виносяться на підсумковий контроль
- •Література
Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів
1. Промислові способи одержання ферментів, їхнє застосування.
2. Глибинний метод культивування продуцентів ферментів.
3. Поверхневий метод культивування продуцентів ферментів.
4. Іммобілізація ферментів.
5. Класифікація носіїв.
6. Методи іммобілізації.
7. Застосування іммобілізованих ферментів.
8. Іммобілізація клітин.
Класифікація ферментів основана на механізмі їхньої дії й включає 6 класів. Ферменти – біокаталізатори володіють рядом унікальних властивостей, наприклад, таких як висока каталітична активність і вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютну специфічність, каталізуючи перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітична дія максимальна. При різкій зміні рН ферменти інактивуються шляхом необоротної денатурації. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітовано певними межами, оскільки вже при температурі 40 – 50С багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.
Оскільки ферменти – речовини білкової природи, у суміші з іншими білками їх кількість визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті може бути встановлена лише за протіканням тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку вмісту ферменту можна дати, визначивши або кількість продуктів реакції, які утворилися, або кількість субстрату, що витратився. За одиницю активності ферменту приймають ту його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за 1 хвилину при заданих стандартних умовах – стандартна одиниця активності.
За рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30С за початковою швидкістю реакції, коли концентрація насичення ферменту й тимчасова залежність близька до кінетики реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність препарату, який випускається – найважливіший нормований показник якості.
Основну частину ферментів, які одержують промисловим способом, становлять гідролази. До них відносяться, у першу чергу амілолітичні ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їхня основна функція – гідроліз крохмалю й глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються в спиртовій промисловості, хлібопеченні.
Протеолітичні ферменти належать до класу пептидгідролаз. Їх дія полягає в прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість – селективний характер дії на пептидні зв'язки в білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин – на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній області рН: рН 1,5 – 3,7 – кислі протеази; рН 6,5 – 7,5 – протеази; pН > 8.0 – лужні протеази.
Протеази знаходять широке застосування в різних галузях промисловості: м'ясна – для пом'якшення м'яса; шкіряна – пом'якшення шкір; кіновиробництво – розчинення желатинового шару при регенерації плівок; парфумерна – добавки в зубну пасту, креми, лосьйони; виробництво миючих засобів – добавки для видалення забруднень білкової природи; медицина – при лікуванні запальних процесів, тромбозів і т.д.
Пектолітичні ферменти зменшують молекулярну масу й знижують в'язкість пектинових речовин. Пектинази діляться на дві групи – гідролази й транселімінази. Гідролази відокремлюють метильні залишки або розривають глікозидні зв'язки. Транселімінази прискорюють негідролітичне розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві – висвітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.
Целюлолітичні ферменти дуже специфічні, їхня дія проявляється в деполімеризації молекул целюлози. Використовуються у вигляді комплексу, який здійснює гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізній промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій – для поліпшення якості рослинних масел, у сільському господарстві – як добавки в комбікорми для жуйних тварин.
Існує ряд факторів, які впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів й одержати штами з необхідними для промисловості властивостями. До мутагенних факторів відносяться іонізуюче й неіонізуюче випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, які перетворюють спадкоємні елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора в біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу поживного середовища При цьому важливим є не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але й речовин, що відіграють роль індукторів або репресорів біосинтезу даного конкретного ферменту або його груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт повинен ураховуватися при виборі технології.
Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середовище крохмалю й при повному видаленні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатна збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад поживного середовища й умови культивування. При розробці процесу біосинтезу α-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерела вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодового екстракту (із пророслого насіння злакових) ще в 10 разів, а підвищення концентрації основних елементів поживного середовища на 50% – ще в 2 рази.
Для інтенсифікації процесу росту й синтезу ферментів додають різні фактори росту, наприклад, амінокислоти, пуринові основи та їх похідні, РНК і продукти їх гідролізу. Як джерело вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати й мінеральні джерела азоту. До складу поживного середовища входять й іони Mg, Mn, Zn, Fe, Cu й ін. метали. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість α-амілази, іони Fe й Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.
Оптимальний склад поживного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричним і побудовою математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, природно, переважніше. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві групи: глибинний і поверхневий методи.