Ендосимбіотичні асоціації

В ізольовані протопласти рослин вводили мікроорганізми наступних систематичних груп: бактерії, дріжджі, ціанобактерії, ціанели.

Існує кілька способів введення мікроорганізмів в протопласти:

– ендоцитоз (інвагінація плазма леми), при цьому везикула з мікроорганізмом звільняється в цитоплазмі протопласту;

– інтеграція (злиття) мембран протопласту і мікроорганізму, органели водоростей вивільняються в цитоплазму протопласту, але при цьому вони не оточені плазма лемою протопласта.

– введення мікроорганізму у штучні мембрани – ліпосоми. Наприклад, в протопласти цибулі вводили ціанобактерії, поміщені в ліпідні краплі.

Кожен з методів має свої переваги і недоліки. В першому випадку везикули, оточені цитоплазматичною мембраною протопласту, в результаті чого може відбутися злиття з лізосомами і руйнування мікроорганізму.

У другому випадку відбувається порушення цілісності мікроорганізму: в цитоплазмі опиняються органели.

В третьому випадку в цитоплазмі опиняються інтактні мікроорганізми, що являється однією з умов відтворення природного симбіозу. Такого ж результату можна досягти, використовуючи метод мікроін’єкцій (наприклад – ціанобактерій) в простір між стінкою і плазмольованою клітиною цибулі. Цей спосіб можна розглядати або як стадію перед попаданням бактерій в цитоплазму, або як одержання асоціацій міжклітинного типу.

На жаль, життєздатних систем на основі ізольованих протопластів в даний час не одержано, так як в процесі культивування відбувалось руйнування або мікроорганізму, або протопласту. Необхідні подальші дослідження.

Екзосимбіотичні асоціації з водоростями, грибами, азотфіксаторами

Парнери ті ж, в основному – азотфіксатори (Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum), Chlorella та різні види грибів. Загальний принцип створення таких асоціацій – спільне культивування клітин рослин з мікроорганізмами. Способи введення мікроорганізмів в культуру можуть бути різні: внесення мікроорганізмів безпосередньо в культуру; висів на поверхні агару поряд з каллусом, але без дотикання, розділення бактеріальних клітин і культури мембранами, які забезпечують обмін продуктами метаболізму, але не допускають контакту між партнерами.

Розглянемо результати спроб створення асоціацій з різними партнерами.

Асоціації з бульбочковими бактеріями. Спочатку створювались спрощенні модельні системи для вивчення симбіозу бобових рослин з клітинами рослин. Каллусну тканину сої інфікували клітинами Rhizobium. Було одержано щось подібне до інфекційних ниток і бактероїдів в каллусній клітині. В таких асоціаціях клітини бактерій проявляли нітрогеназну активність (НГА), яка відсутня в чистій культурі. Це свідчило про процес азотфіксації.

Далі були створені і азотфіксуючі асоціації Rhizobium з культурами тканин небобових рослин. В таких асоціаціях клітини бактерій були локалізовані на поверхні рослинних клітин, проникали вглиб каллуса по міжклітинникам і зрідка виявлялися всередині клітин. В основному зберігали паличкоподібну форму без утворення бактероїдів. В більшості таких експериментів бактеріальні клітини пригнічували ріст рослинних і посилювали їх відмирання. Повідомлення про позитивний взаємний вплив одиничні. Є одна вдала спроба регенерації рослин тютюну з асоціації каллусної тканини з Rhizobium.

Асоціації з вільноживучими азотфіксаторами. Azotobacter, Azospirillum живуть в ризосфері рослин та іноді утворюють з ними асоціації. Головне завдання проведення експериментів з цими бактеріями – одержання ефективних азотфіксуючих систем, які ростуть на середовищі без зв’язаного азоту, з перспективою регенерації рослин.

В таких експериментах була виявлена видова специфічність. Каллусні культури тютюну, проса швидко «обростали» Azospirillum, але через 4 тижні гинули. Тканина цукрової тростини субкультивували в аналогічних умовах 18 місяців, при цьому стабільні асоціації формувалися лише на середовищі з низьким вмістом зв’язаного азоту або без нього. Бактерії проявляли НГА в усіх віипадках.

І Azotobacter, і Azospirillum у відповідних асоціаціях були локалізовані на поверхні або в міжклітинниках і ніколи не проникали всередину клітини. Рослини-регенеранти поки що не одержані.

Асоціації із зеленими водоростями. Каллус моркви інокулірували одним із штамів Chlorella, культивували на світлі на середовищі з дефіцитом азоту, каллус жив кілька місяців. Контрольні ж рослини гинули. Клітини водорості не проникали всередину рослинних.

Асоціації з грибами. Тканину рути окремо культивували з різними грибами, при цьому на клітини рослин впливали дифундуючи через агар виділення гриба. В деяких випадках додавали культуральну рідину грибів. Спільне культивування з Botritis allii збільшувало синтез алкалоїдів в 10 разів в порівнянні з контролем, а додавання культуральної рідини – в 50 разів.

Ціанобактерії у штучних асоціаціях з рослинними клітинами. Ціанобактерії як партнери у штучних асоціаціях мають ряд особливостей: передбачають, що древні ціанобактерії відіграли роль в формуванні еукаріотичної клітини; частіше інших фототрофів вступають в симбіотичні відносини з іншими організмами в природі; в симбіозах здійснюють різні метаболічні функції: з автотрофами грають роль азотфіксаторів, з гетеротрофами забезпечують партнерів продуктами фотосинтезу; здатні виділяти в середовище вуглеводи, амінокислоти, пептиди, вітаміни, гормони; в процесі фотосинтезу виділяють кисень, який рослини споживають в процесі дихання; знаходять практичне застосування у покращенні забезпечення рослин зв’язаним азотом.

Перешкодою можуть слугувати різні вимоги до умов культивування: у клітин рослин оптимум рН 5 – 5,5, а ціанобактерій нейтрально-лужного (7 – 10); для рослинних клітин температурний оптимум 24 – 27С, для бактерій – 30 – 40С, концентрація мінеральних солей в середовищі для вирощування рослинних клітин вище, ніж потрібно для ціанобактерій.

В дослідженнях, проведених на кафедрі клітинної фізіології МГУ, перевірялись різні співвідношення партнерів, з використанням як каллусних, так і суспензійних культур. Було відмічено ряд фізіологічних реакцій: від іегібування одного партнера іншим до взаємної стимуляції процесів життєдіяльності.

В суспензійних культурах клітин тютюну і Anabaena nidulans відмічено наступне:

– взаємна стимуляція росту, коли в умовах, неоптимальних для росту кожного компоненту системи, відбувалась взаємна стимуляція;

– двохфазність ростових процесів: за піком росту ціанобактерій слідує пік росту рослинних клітин, який супроводжується частковою деградацією ціанобактерій. Припускається, що в першій фазі росту відносини партнерів носять характер мутуалізма;

– ціанобактерії адсорбуються на поверхні клітин, проникають вглиб клітинних агрегатів, але частина партнерів залишається в суспензії у вільному стані;

– рослинні клітини споживають продукти фотосинтезу ціанобактерій;

– між клітинами рослин і мікроорганізмів встановлюються метаболічні взаємодії, які можуть призвести до стимуляції видоспецефічних біосинтезі рослинних клітин.

Асоціації каллусних тканин з ціанобактеріями одержували двома способами:

Використовували ізольовані протопласти, виділені з дефіцитних по хлорофілу частин мезофілу листка, до якого підсівали суспензію A.variablis.

При цьому каллусні культури стабільно росли не менше 2 років. Антагонізму не було.

Додаючи в середовище ауксини і цитокініни, вдалося викликати органогенез у каллуса тютюну, асоційованого з ціанобактерією. Сформувались білі пагони регенерантів тютюну з ділянками синьо-зеленого кольору, які містили бактерії. В регенерантах з каллуса ціанобактерії мали внутрішньотканинну локалізацію і виявлялись лише в листках. Їх також знаходили на поверхні листя, стебла, в судинній системі, продихах.

Результати з одержання асоціацій ціанобактерій з рослинами-регенерантами являють інтерес в зв’язку з проблемою підвищення частки біологічно зв’язаного азоту в азотному живлення рослин.