Глибинний метод виробництва ферментів

У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі Технічно цей метод більш досконалий, ніж поверхневий, тому що легко піддається автоматизації й механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні зазвичай значно нижча, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як й у будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.

1. Готування поживного середовища залежить від складу компонентів. Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для готування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня забрудненості сторонніми мікроорганізмами об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації й апарати. Повітря очищається до й після аерування. До початку, тому що містить частки пилу органічної й неорганічної природи, після – тому що несе клітини продуцента.

2. Одержання засівного матеріалу. Для засівання поживний матеріал середовища готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій – молода ростуча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу складається в збільшенні маси продуцента в 3 – 4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко росте (до 5 – 20%). Якщо ж відбувається швидке спороутворення – скорочується до 1%.

3. Виробниче культивування. Біосинтез ферментів у глибинній культурі протікає протягом 2 – 4 діб при безперервній подачі повітря й перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах може гальмувати ріст біомаси продуцента, тому часто свіже середовище або деякі його компоненти вводяться у ферментер на стадії активного росту. Температурний оптимум перебуває в інтервалі 22 – 32С. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості метаболітів, що утворилися, і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, що визначає стратегію корекції процесу й автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкраща якість продуктів.

4. Виділення. У міцелії тридобової культури залишається не більше 15% ферментів. Інші виділяються в навколишні клітини або рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють із фільтратів після відділення біомаси.

5. Одержання товарної форми.

Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів

При поверхневому методі культура росте на поверхні твердого зволоженого поживного середовища Міцелій повністю обволікає й досить міцно скріплює тверді частки субстрату, з якого одержує поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинно бути пухким, а шар культури-продуцента невеликим.

Вирощування виробничої культури відбувається в асептичних умовах, але середовище й кювети необхідно стерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування.

Переваги поверхневої культури: значно більша висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрюванні крохмалю 5 кг поверхневої культури заміняють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

Посівний матеріал може бути трьох видів:

– культура, що виросла на твердому поживному середовищі;

– споровий матеріал;

– міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.

У три етапи одержують і посівну культуру. Спочатку вихідну культуру продуцента висівають на 1 – 1,5 г зволожених стерильних пшеничних висівках у пробірці й вирощують у термостаті до надлишкового спороутворення. Другий етап – аналогічний, але в колбах, третій – у судинах з 500 г середовища.

Основа складу поживного середовища – пшеничні висівки – джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до них можна додавати бурячний гніт, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середовище водяною парою при помішуванні (температура – 105 – 140С, час 60 – 90 хвилин). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають у ростові камери. Культивують протягом 36 – 48 годин.

Ріст ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набрякання конідій й їхнє проростання (температура не нижче 28С), потім ріст міцелію у вигляді пушка сірувато-білого кольору (необхідно виводити надлишкове тепло) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту й розвитку продуцента необхідні аерація й підтримка оптимальної вологості (55 – 70%).

Культура, яка виросла на нерухомому шарі при поверхневому культивуванні представляє корж із набряклих часток середовища, міцно зв'язаних зрослим міцелієм. Масу подрібнюють до гранул 5 мм. Культуру висушують до 10 – 12% вологості при температурах не вище 40С, не більше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді – у шкіряній і спиртовій промисловості. У харчовій й особливо медичній промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

Схема очищення зводиться до наступного:

– видалення нерозчинних речовин;

– видалення супутніх розчинних речовин;

– фракціонування (хроматографічними методами).

Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген – вода. При цьому в розчин переходять цукри, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення й очищення завершує сушіння. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6 – 8% вологи, тоді він може в герметичній тарі зберігатися до року без втрати активності.

Стандартизація ферментного препарату – доведення активності ферменту до стандартного, який відповідає вимогам держстандарту. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі – крохмаль, лактоза й ін.

З огляду на величезні перспективи застосування ферментних препаратів у різних галузях промисловості й сільського господарства, медицині, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень у цій області для оптимізації технології й гарантійного одержання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів.