Застосування іммобілізованих ферментів

Особливо відчутний внесок іммобілізовані ферменти внесли в органічний синтез, в аналіз, у медицину, у процеси конверсії енергії, у харчову й фармацевтичну промисловості.

Для синтетичної органічної хімії важливо те, що у двофазних реакційних середовищах фермент зберігає каталітичну активність навіть при винятково малому вмісті води, тому рівновагу реакції (вихід продукту) експериментатор може регулювати в широких межах, підбираючи потрібний органічний розчинник. Іммобілізовані ферменти дали поштовх до створення принципово нових методів "безреагентного" безперервного аналізу багатокомпонентних систем органічних (у ряді випадків і неорганічних) сполук.

У наш час надзвичайно важливу роль за контролем навколишнього середовища й у клінічній діагностиці відіграють такі методи, як біолюмінесцентний аналіз й іммуноферментний аналіз.

У медицині іммобілізовані ферменти відкрили шлях до створення лікарських препаратів пролонгованої дії зі зниженою токсичністю й алергенністю. Іммобілізаційні підходи сприяють рішенню проблеми спрямованого транспорту ліків в організмі.

Проблеми біоконверсії маси й енергії в цей час намагаються вирішити мікробіологічним шляхом. Проте іммобілізовані ферменти вносять відчутний вклад у здійснення фотолізу води й у біоелектрокаталіз.

Заслуговує уваги й використання іммобілізованих ферментів у процесах переробки лігноцелюлозної сировини.

Іммобілізовані ферменти можуть використовуватися і як підсилювачі слабких сигналів. На активний центр іммобілізованого ферменту можна подіяти через носій, піддаючи останній ультразвуковій обробці, механічним навантаженням або фотохімічним перетворенням. Це дозволяє регулювати каталітичну активність системи фермент – носій під дією механічних, ультразвукових і світлових сигналів. На цій основі були створені механо- і звукочутливі датчики.

Промислові процеси із застосуванням іммобілізованих ферментів впроваджені насамперед у харчову й фармацевтичну промисловість. У харчовій промисловості за участю іммобілізованих ферментів здійснюють процеси одержання глюкозо-фруктових сиропів, глюкози, яблучної й аспарагінової кислоти, оптично активних L-амінокислот, дієтичного безлактозного молока, цукрів з молочної сироватки й ін.

У медицині іммобілізовані ферменти використовуються також як лікарські препарати, особливо в тих випадках, коли необхідний локальний вплив. Крім того, біокаталізатори широко використовуються в різних апаратах для перфузійного очищення різних біологічних рідин. Можливості й перспективи використання в медицині ферментів в іммобілізованому стані набагато ширші, ніж досягнуті на сьогоднішній день, саме на цьому шляху медицину чекає створення нових високоефективних методів лікування.

Іммобілізація клітин

У 70-х роках XX століття з'явилися перші публікації про іммобілізацію клітин мікроорганізмів, а перше промислове застосування іммобілізованих клітин було здійснено в Японії в 1974 р. З їхньою допомогою одержували аспарагінову кислоту.

Іммобілізовані клітини мають ряд переваг як перед іммобілізованими ферментами, так і перед вільними клітинами:

– відсутність витрат на виділення й очищення ферментів;

– зниження витрат на виділення й очищення продуктів реакції;

– більш висока активність і стабільність;

– можливість створення безперервних і напівбезперервних автоматизованих процесів;

– здатність до тривалого функціонування поліферментних систем без екзогенних кофакторів.

Для іммобілізації можуть бути використані клітини в різному стані: живі й ушкоджені в різному ступені. Одностадійні реакції можуть здійснювати й живі, і ушкоджені клітини. Поліферментні реакції проводять із застосуванням живих клітин, які можуть тривалий час регенерувати АТФ і коферменти (НАДФ, НАД).

Проблема використання ферментативної активності іммобілізованих мікроорганізмів має глибоке коріння. Більше 150 років тому швидкий спосіб одержання оцту був заснований на застосуванні мікроорганізмів, адсорбованих на деревній стружці. Методи іммобілізації клітин схожі з методами іммобілізації ферментів.

Хімічний метод заснований на утворенні ковалентних зв'язків з активованим носієм, на поперечній зшивці клітин за рахунок активних груп у клітинній оболонці з біфункціональними реагентами (наприклад, глутаровим альдегідом).

До фізичних методів відносяться адсорбція й агрегація.

Іммобілізація клітин шляхом включення в різні гелі, мембрани, волокна заснована на хімічних і фізичних взаємодіях. Хімічні методи використовуються рідше в порівнянні з іншими методами й малопридатні для іммобілізації живих клітин. Найбільшого поширення одержало включення клітин до складу гелів, мембран і волокон. При такому способі іммобілізації клітини можуть зберігати життєздатність й у присутності поживного середовища розмножуватися в приповерхневих шарах гелю. Біокаталітична активність цілих іммобілізованих клітин у цей час може бути використана в різних галузях науки й техніки:

– при біосинтезі й трансформації таких сполук, як амінокислоти, органічні кислоти, антибіотики, стероїди, вуглеводи, вуглеводні, нуклеотиди й нуклеозиди;

– у пивоварстві й виноробстві;

– при очищенні стічних і природних вод;

– при екстрагуванні металів зі стічних вод;

– при асиміляції сонячної енергії;

– при виготовленні водневих сонячних елементів;

– в азотфіксації;

– в аналітичних цілях при виготовленні електродів.

Найбільша кількість досліджень по іммобілізації клітин мікроорганізмів проведена японськими дослідниками. Особливі успіхи були досягнуті ними в області синтезу амінокислот, органічних кислот й антибіотиків. У Московському державному університеті був розроблений метод одержання аспарагінової кислоти, який за ефективністю не уступає японським. Клітини E.coli, включені в армований поліакриламідний гель, були з успіхом використані для одержання аспарагінової кислоти, період напівжиття каталізатора – 110 діб. Іммобілізувати можна не тільки клітини мікроорганізмів, але й клітини рослинних і тваринних тканин, використовуючи їх для синтезу фізіологічно активних сполук.

Цікаві можливості відкриваються й при іммобілізації клітинних органел як активних поліферментних систем. Все це свідчить про перспективність розвитку одного з напрямків біотехнології, пов'язаного з вивченням і застосуванням іммобілізованих клітин.

Лекція № 8. Біотехнологія препаратів для сільського господарства

1. Бактеріальні ентомопатогенні препарати.

2. Грибні ентомопатогенні препарати.

3. Вірусні ентомопатогенні препарати.

4. Бактеріальні добрива на основі бульбочкових бактерій.

5. Технологія одержання азотобактерину.

6. Технологія одержання фосфобактерину.

7. Антибіотики для сільського господарства.

Ентомопатогенні препарати на основі бактерій

Препарати, які виробляються для сільського господарства, діляться на 3 групи: ентомопатогенні препарати; бактеріальні добрива; антибіотики.

Вітчизняне біотехнологічне виробництво випускає 3 групи ентомопатогенних препаратів:

1. Бактеріальні препарати на основі Bacillus thuringiensis – ентобактерин-3, дендробацилін, інсектин, токсобактерин.

2. Грибний препарат боверин на основі гриба Beauveria bassiana.

3. Препарати на основі вірусів ядерного поліедра (вірин-енш, вірин-экс й ін.).

Всі мікробні патогени випускаються у вигляді змочувальних порошків, паст, рідше – гранул, емульсії спор і кристалів. При безпосередньому застосуванні передбачається використання різних добавок у вигляді розчинників, проклеювачів, які сприяють підвищенню їхньої ефективності. Найбільш поширеними серед промислових мікробних патогенів є бактеріальні препарати. Їхніми відмінними рисами є висока вірулентність стосовно комах-шкідників, безпека для навколишньої флори й фауни, досить висока швидкість впливу на шкідників й ін. У цей час виробляються препарати проти більше 160 видів комах.

Із всіх ентомопатогенних бактерій найбільш досліджені грампозитивні бактерії Bac.thuringiensis. Вони не тільки убивають комах, потрапляючи усередину, але й продукують ряд токсичних продуктів. Серед цих токсичних продуктів виділяють 4 компоненти:

– α-екзотоксин, або фосфоліпаза С, – продукт ростучих клітин бактерій. Токсичну дію ферменту пов'язують із індукованою нею реакцією розпаду незамінних фосфоліпідів у тканинах комах, що призводить до загибелі останніх.

– β-екзотоксин – накопичується в культуральній рідини при рості клітин. Уважають, що молекула β-токсину складається з нуклеотиду, зв'язаного через рибозу й глюкозу з алослизевою кислотою. Його дія, мабуть, обумовлена інактивацією нуклеотидази й Днк-днк-залежної-Рнк–полімерази, зв'язаних з АТФ, що призводить до припинення синтезу РНК. У порівнянні з іншими токсинами діє повільніше, в основному при переході від одного циклу розвитку до іншого. За спостереженнями, β-екзотоксин – мутаген, який вражає генетичний апарат особин.

– γ-екзотоксин – маловивчений компонент, неідентифікований фермент (або група ферментів).

– δ-ендотоксин – параспоральний кристалічний ендотоксин. Утворюється в процесі споруляції бактерії в протилежній від спороформуючої частині бактерії. На завершальній стадії спороутворення токсин набуває форми 8-гранного кристалу. Кристали складаються з білка, амінокислотний склад якого близький для різних штамів. Доведено, що кристалічний білок у кишечнику сприйнятливих комах розпадається на молекули протоксину. Протоксин під дією протеіназ розпадається на токсичні фрагменти. Розходження в сприйнятливості деяких видів комах до дії кристалів, очевидно, пов'язане із присутністю спеціальних кишкових протеаз, що здійснюють гідроліз кристалів in vivo. Такими протеазами володіють не всі комахи, звідси й вибірковість дії δ-токсину. Щоб комаха загинула, кристали повинні потрапити до її організму. Після поглинання кристалів гусениці перестають харчуватися. Первинним місцем дії δ-токсину є середній відділ кишечнику.

Залежно від реакції на кристали комахи діляться на три групи: характерний загальний параліч; параліч середнього відділу кишечнику; реакція на препарат у цілому: загибель у результаті проростання спор й наступне розмноження бактерій.

Бактерії Bac. thuringiensis антагоністичні до 130 видів комах. Найбільший ефект досягається при застосуванні препаратів цієї групи проти листоїдних шкідників. Найпоширеніші препарати на основі різних варіацій Bac. thuringiensis: ентобактерин, інсектин, алестин, екзотоксин, токсобактерин, дендробацилін, бітоксибацилін.

Промислове виробництво ентомопатогенних бактерій полягає в глибокому культивуванні. При цьому ставиться завдання одержання максимального титру клітин у культуральній рідині й нагромадження токсину. Вимоги до промислових штамів ентомопатогенних бактерій: приналежність штаму до певного серотипу, висока вірулентність і продуктивність на промислових середовищах, стійкість до комплексу фагів і т.д. Технологія виробництва включає всі стадії, типові для будь-якого біотехнологічного виробництва. Температуру культивування на всіх стадіях підтримують постійною (28 – 30С), тривалість ферментації становить 35 – 40 годин. Використовують дріжджі-полісахаридне середовище, яке містить у відсотках: кормові дріжджі – 2 – 3; кукурудзяне борошно – 1 – 1,5; кашалотовий жир – 1. Перед початком культивування рН становить близько 6,3, до кінця ферментації – підвищується до 8,0 – 8,5, що може призвести до руйнування кристалів на більш дрібні фрагменти й ускладнити їх виділення. Щоб запобігти цьому, культуральну рідину перед переробкою підкислюють до 6,0 – 6,2. Культивування закінчують при ступені споруляції 90 – 95% і титрі спор не менш 10⁹ в 1 мл. Після сепарації культуральної рідини одержують пасту вологістю 85% з виходом близько 100 кг на 1 кубометр культуральної рідини й титром порядку 20×10⁹ спор в 1 грамі. Фугат можна використати для подальшого виготовлення поживного середовища але не більше 1 – 2 разів, тому що в культуральній рідині накопичуються речовини, які гальмують розвиток культури. Фугат знаходить своє застосування також як сировина при виробництві кормових дріжджів, що забезпечує скорочення промислових стоків і знижує витрату води.

Пасту перемішують протягом напівгодини для однорідного розподілу спор і кристалів і відбирають проби на перевірку титру, вологості, вірулентності, наявності фагів.

Кінцевий продукт – змочувальний порошок або стабілізована паста. Перший одержують шляхом висушування зволоженої пасти (ліофілізація). Готовий препарат фасують по 20 кг у чотиришарові крафт-мішки з поліетиленовою вкладкою. Другий – внесенням у пасту КМЦ. При змішуванні молекули КМЦ сорбують білкові кристали й спори, заряджаючи їх негативно, що сприяє рівномірному розподілу активного початку по всьому обсязі й збільшенню строку зберігання. Готовий препарат – грузла рідина кремового або ясно-сірого кольору, без запаху, що не замерзає при зберіганні. Препарат призначений для боротьби із садово-городніми шкідниками, ефективний проти 60 видів комах. Застосовують шляхом обприскування рослин водною емульсією в період активного росту шкідника. Основна маса шкідників гине протягом 2 – 10 днів. На 1 га витрачають: для овочевих культур 1 – 3 кг, садових – 3 – 5 кг.