- •Главное управление аграрного образования витебская государственная академия ветеринарной медицины
- •Ихтиопатология
- •Витебск 1999
- •О г л а в л е н и е
- •Часть 1. Общая ихтиопатология
- •1.1. Особенности анатомии и биологии рыб
- •1.2. Ихтиопатологическая лаборатория (ипл)
- •1.3. Общие санитарно-профилактические мероприятия в рыбоводных хозяйствах
- •Способы применения лечебных препаратов, дезинфицирующих и дезинвазирующих средств
- •1.4. Акт эпизоотологического обследования рыбоводного хозяйства
- •Тема 2. Методы ихтиопатологических исследований
- •2.1. Правила взятия патматериала и пересылки больной рыбы
- •2.2. Клиническое исследование
- •2.3. Гематологическое исследование
- •Взятие крови у рыб
- •2.4. Патологоанатомические исследования
- •Бактериологическое исследование
- •2.6. Вирусологическое исследование
- •2.7. Микологическое исследование
- •Паразитологическое исследование
- •2.9. Постановка биопробы
- •Часть II. Частная ихтиопатология болезни инфекционной этиологии
- •Тема 3 вирозы
- •Тема 4. Бактериозы
- •Тема 5. Микозы
- •Тема 6. Протозоозы
- •Тема 7 . Моногеноидозы. Трематодозы.
- •Тема 8. Цестодозы, нематодозы
- •Тема 9. Бделлозы, крустацеозы
- •Тема 10. Зооантропонозы
- •Тема 11. Незаразные болезни
- •Рекомендуемая литература
- •П р и л о ж е н и е
- •Ветеринарно-санитарные, профилактические и оздоровительные мероприятия в рыбоводных хозяйствах
- •Специальные мероприятия в неблагополучных по заразным болезням рыб хозяйствах
2.6. Вирусологическое исследование
Исследование включает культивирование на культуре клеток и идентификация вируса, постановка биопробы. Для культивирования вирусов используют первично трипсинизированную культуру клеток или используют перевиваемые культуры клеток, обладающих бесконечной потенцией роста in vitro (FHM, RIG2, EPC). Перевиваемые культуры выбирают исходя из предполагаемой природы вируса. Первично трипсинизированную культуру клеток готовят из гонад самок рыб II-й и III-й стадии зрелости по шкале Киселевича. Гонады измельчают и промывают раствором Хенкса или Эрла и переносят в колбу для трипсинизации. Для трипсинизации используют 0,5%-ный раствор трипсина вместо 0,25%, так как работа ведется при комнатной температуре. Отношение объема измельченных гонад к раствору трипсина 1:10. Колбу с содержимым помещают на магнитную мешалку сроком на 10-15 минут, количество оборотов регулируют так, чтобы в колбе не образовывалось пены. Затем надосадочную жидкость сливают, добавляют такое же количество раствора Хенкса или Эрла и ставят на магнитную мешалку на 10-15 минут. Надосадочную жидкость сливают и к ней приливают такое же количество трипсина, затем помещают на магнитную мешалку. Всю процедуру повторяют до тех пор, пока от кусочков ткани в колбе прекратится отделение клеток.
Клеточную взвесь собирают в отдельный флакон и добавляют небольшое количество сыворотки крови крупного рогатого скота для прекращения процессов ферментации и помещают в холодильник на лед. Экспозиция 2 часа. Затем клетки центрифугируют при 600 в течение 20 минут.
Для подсчета клеток к 1 мл клеточной суспензии добавляют 1 мл 0,5%-ного раствора трипанового синего, подсчет ведут в пяти больших квадратах камеры Горяева. Считают только неокрашенные клетки.
После этого клетки вливают в питательную среду (600 тыс.клеток на 1 мл среды). Для получения необходимой концентрации к клеточной взвеси добавляют соответствующее количество питательной среды и сыворотки (конечная концентрация сыворотки 10-15%). Деконтаминацию проводят добавлением антибиотиков.
Клетки высевают в пробирки (1 мл) и инкубируют в термостате при температуре 28-300С. Монослой образуется на 3-5-й день. Через каждые 7-10 дней проводят смену среды с целью увеличения срока жизни культуры.
Для этого используют перевиваемые культуры клеток:
FHM - из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна
RTG 2 - из гонад радужной форели
EPC - из клеток оспенных разростов на коже карпа.
Заражение культуры клеток проводят приливая обработанную суспензию патматериала в таком количестве, что бы только покрыть монослой. Одной пробой заражают культуру в 3-4-х пробирках. Столько же пробирок в контроле.
Степень поражения клеточного монослоя выражают в крестах (25% - +; 50% - ++; 75% - +++; 100% - ++++).
Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронную микроскопию, изучение физико-химических свойств вируса, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках, серологические методы (РН, РП, РСК и др.).
Для доказательства вирусной этиологии заболевания необходимо выполнение постулатов Риверса: выделение вируса из организма больного животного; пассажирование на культуре клеток или чувствительных животных; доказательство вирусной природы выделенного агента; воспроизведение подобного заболевания у здорового животного того же им родственного вида; повторное выделение того же вируса от экспериментально зараженного животного.