Tec_V_V_Mikroorganizmue_i_antibiotiki_Zaboleva_BookFi_org

Ïатогенность и концентрация микроорганизмов

âсредней порции мочи

Таблица 5.1

		Концентрация выделенных микроорганизмов (%)
Патоген-
	A	B	C	D
ность	Обычные	Не очень	Необычные	Редкие
	(>10%)	обычные (1-10%)	(0.1-1%)	(<0.1%)
				ÑÎ2 зависимая
I				E. Ñoli
Первичные	E. coli	S. saprophyticus		Salmonella spp.*
патогены				(Leptospira
				mycobacteria)
		Enterobacter spp.	Citrobacter spp.,	Corynebacterium
II		Enterococcus spp.	M. Morganii
				urealyticum
Вторичные		Klebsiella spp.	P. Vulgaris
				Haemophilus spp.**
патогены		P. Mirabilis	Serratia spp.
				Pneumococci **
		P. aeruginosa	S. aureus
				Опубликовано
III			Acinetobacter spp.	большое количество
Сомни-		GBS***, дрожжи	Pseudomonas spp.	работ, в которых
тельные		CNS (прочие)****	Stenotrophomonas	возбудителем
патогены			maltophilia	инфекции являются
				другие штаммы.
IV		α стрептококки
Обычная			Bifidobacterium
		Gardnerella
óðåò-			spp.
		vaginalis,
ральная или			"Дифтероидные"
		Лактобактерии
генитальная			палочки
		è ò.ä.
флора*****

Примечание: * — во всех работах отмечается присутствие низких концентраций этих штаммов, даже если, по всей вероятности, причиной их наличия является контаминация во время забора материала для исследования; ** — наиболее часто высевается у детей; *** — группа В стрептококков (S. agalactiae); **** — коагулазоотрицательные стафилококки, уреаза образующие штаммы или изоляты, выделенные от больных с постоянными катетерами; ***** — не идентифицируется и чувствительность к антибиотикам не определяется (лишь в исключительных случаях, когда на то есть указание).

вания на антибиотикочуствительность и антибиотикотерапию чтобы не вызвать появление мультирезистентных штаммов. Однако, обследование такой группы населения, как беременные, должно быть гарантировано.

Медицинские показания для назначения микробиологического исследова ния мочи:

a)Подозрение на острый пиелонефрит, инфекцию мочевыводящих путей, сопровождающуюся лихорадкой;

b)Подозрение на больничную инфекцию мочевыводящих путей;

c)Подозрение на инфекцию мочевыводящих путей у таких предрасполо женных к этому пациентов, как диабетики или больные с аномалиями мочевы водящих путей, страдающих мочекаменной болезнью или иммуноскомпромети рованных.

141

d)Пациентов, ослабленных первичным курсом антимикробной химиотера

пии.

e)Лихорадящие пациенты с постоянными катетерами

f)Клинические признаки инфекции мочевыводящих путей у мужчин

g)Клинические признаки инфекции мочевыводящих путей у беременных женщин

h)Подозрение на инфекции мочевыводящих путей у детей и подростков. 2. Показания для бактериального исследования мочи до вида и атибиотико

чувствительность после завершения лечения.

Анализ мочи на количественное определение бактерий и чувствительность к антибиотикам должен непременно проводиться для всех пациентов перечислен ных выше.

3. Показания для бактериального исследования мочи после завершения ле чения.

Женщины из группы пониженного риска, у которых исчезли симптомы вос паления после завершения терапии острого цистита, не нуждаются в бактери альном исследовании мочи.

Бактериальная флора мочевыводящих путей Присутствие микроорганизмов в моче, само по себе, еще не свидетельствует

об инфекции. В то же время, обнаружение некоторых из них, чаще всего свиде тельствует о наличие патологического процесса.

Классификация микроорганизмов, основанная на способности вызывать инфекции мочевыводящих путей.

Существует классификация возбудителей инфекции мочевыводящих путей, согласно которой различные микроорганизмы подразделены на 16 категорий по степеням патогенности ( I IV) и по частоте возникновения заболеваний (А D) (табл. 5.1). Эта основана на многолетнем опыте исследований в клинической микробиологии.

Степень патогенности (способность вызывать заболевание) можно класси фицировать следующим образом:

I.Первичные патогены. Это бактерии, вызывающие инфекции мочевыво дящмх путей у здоровых людей. В эту группу входят E. сoli и S. saprophyticus. Известны редкие случаи, когда инфекцию вызывали и другие бактерии, напри мер, Salmonella spp.

II.Вторичные патогены. Это бактерии, которые редко вызывают инфекции

вкачестве первичных, но часто являются источником больничных инфекций мо чевыводящих путей. К ним, обычно, относятся такие бактерии, как Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp.,Morganella morganii, S. aureus and Enterococcus spp.

III.Сомнительные патогены. К ним относятся кожная флора и другие виды. Они иногда инфицируют госпитальных больных с инфекциями мочевыводящих путей. Эти патогены могут считаться источником инфекции только в том случае, если будут обнаружены в пробе мочи, взятой из мочевого пузыря. Даже если уроинфекция вызвана коагулазо отрицательным стафилококком, то результаты

142

Ïримеры концентрации микробов, выраженные в

òрадиционных К ОЕ и в рекомендованных К ОЕ (колониеобразующие бактерии)

Таблица 5.2

Традиционно (КОЕ/мл)	Стандартизовано (КОЕ/л)
1	103
103	106
105	108

исследования часто свидетельствуют о контаминации и не могут считаться дос товерными.

IV. Урогенитальная флора. Бактерии относятся к нормальной урогениталь ной флоре. Она часто контаминирует пробы мочи. Исследование на определе ние ее чувствительности к антимикробным препаратам производится лишь в том случае, если об этом есть отдельное указание.

Традиционные критерии Касса.

Долгое время оценка результатов микробиологического исследования мочи проводилась согласно критериям Касса. Касс считал, что у 95% женщин с пие лонефритом содержание одного вида бактерий, наблюдаемое в пробе средней порции мочи, взятой согласно правилам забора, равно КОБ ≥108 (КОЕ ≥105).

Значение низкого содержания бактерий в моче. Stamm et al. Наблюдали 187 сексуально активных женщин с дизурией. Сравнивали результаты посевов проб мочи, взятой из средней порции с результатами посевов проб мочи взятой по средством надлобковой пункции или катетеризации. Колиформы (авторы под этим термином имели ввиду, вероятней всего, бактерии рода Enterobacteriaceae) были выделены из проб, взятых из мочевого пузыря, у 98 женщин (52%), в то время как другие бактерии, в частности S. aureus и S. saprophyticus и энтерокок ки высевались у 26 (14%) Женщины, в мочевом пузыре которых находились колиформы, анализировались дальше в зависимости от значения КОБ/л, чув ствительность составляла 51%.

Большинство острых инфекций мочевыводящих путей вызваны бактериями одного вида. В случае, если в посеве одной пробы мочи присутствует более чем один вид бактерии, результат всегда интерпретируется в зависимости от: а) ка кой из видов доминирующий, б) как был осуществлен забор (катетеризация или средняя порция мочи), в) присутствуют ли другие признаки, помогающие опре делить истинного возбудителя инфекции (БКТ) или вызвавшего контамина цию пробы (чешуйчатые эпителиальные клетки) и г) клинические проявления симптомов и истории болезни. Истинная инфекция может быть вызвана двумя видами бактерий (иногда даже тремя).

По материалам статьи:

ЕСLM European Urinalysis Group European Urinalysis Guidelines Ed. By T. Kouri, G Fogazzi, V Gant, H. Hallander, W. Hofmann and W.G. Guder The Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation 2000, vol. 60, no. Supplement 231, pp. 1 96(96).

143

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ

Методы культивирования бактерий можно разделить на 3 уровня согласно клиническим и бактериологическим задачам: сравнительные методы 3 уровень, количественные методы – 2 уровень и экспресс методы – 1 уровень. Лабора торная служба и клиницисты должны на месте решать, какой уровень исследо ваний должен будет выполнен.

Сравнительный метод культивирования бактерий. К сравнительному методу прибегают, если в этом возникает необходимость, после анализа результа тов исследований посредством рутинной методики или экспресс тестов.

Количество исследуемого образца. Так как пороговое значение для опре деления бактериурии снижено, то необходимо большее количество исследуемо го материала. При помощи точной микропипетки наносят 10 мкл, в результате полученные 106 КОЕ/л будут соответствовать10 колониям на поверхности ага ра, то есть как 105 КОЕ/л соответствует 1 колонии на чашку. На 10 колоний коэффициент вариации = 30% (стандартное отклонение = “10), что происхо дит из за неравномерного распределения бактерий в моче. В случае, если необ ходимо более детальное исследование, например, когда оцениваются частицы бактерий, используют более точные методы, такие как титрование 100 мкл ме тодом серийных разведений.

Культивирование Количественное культивирование производят на CLED агар (цистин лактозо электролит дефицитный агар) для аэробов и на кровяной агар для анаэробов и гематиновый агар для инкубации в СО2 в течение 48 часов по сравнению с 24 часов инкубации в CLED агар при рутинной методике. Срав нение с кровяным агаром особенно важно для подтверждения надежности ру тинной методики и свидетельства качества микробиологических исследований. Параллельный посев на кровяной агар в анаэробных условиях способствует по вышению качества диагностики и рекомендован по следующим причинам: он может помочь при количественной оценке, может вскрыть возможную недосто верность отрицательного результата, полученного на чашках с CLED агаром, улучшает отделение грамположительных бактерий, помогает при идентифика ции изолированных видов и дифференциации контаминантов от уропатогенов.

Рутинное культивирование в чашках.

Оценка результатов микробиологических исследований, совершенно очевид но, требует присутствия здравого смысла. Микробиологические традиции и сто имость медицинских услуг в стране, также, оказывают влияние на оценку. Иде ал, в смысле совершенства в подготовке пациента, сборе исследуемого материа ла, своевременной транспортировке и аналитического процесса может быть и недостижим. Рекомендуемые в предыдущих разделах минимальные объемы материала для инкубации должны служить целью, к которой нужно стремиться

вобычной практике.

Врутинной практике приемлемы одноразовые петли объемом 1мкл, хотя это не лучший вариант. Объем можно увеличить, как это было рекомендовано выше, если на это есть отдельное указание. Результат обычно статистически достове

144

К онтрольные штаммы

Таблица 5.3

	Среда	Штамм	ÀÒÑÑ	Инкубация	Результат
	Кровяной агар	E. coli	25922	35°C, аэробные	Ðîñò
				óñë-èÿ,1äåíü
	Кровяной агар	S. aureus	25923	35°C, аэробные	Ðîñò
				óñë-èÿ,1äåíü
	Кровяной агар	S. pneumoniae	6305	35°C, аэробные	Рост, α гемолиз
				óñë-èÿ,1äåíü
	Кровяной агар	S. pyogenes	19615	35°C, аэробные	Рост, β гемолиз
				óñë-èÿ,1äåíü
	Кровяной агар	C. perfringens	13134	35°C, анаэробные	Рост, гемолиз
	анаэр.			óñë-èÿ,1äåíü
	Кровяной агар	P. anaerobius	27337	35°C, анаэробные	Ðîñò
	анаэр.			óñë-èÿ,1äåíü
	ÑLED àãàð	E. coli	25922	35°C, аэробные	Рост, желтый
				óñë-èÿ,1äåíü
	ÑLED àãàð	E. faecalis	29212	35°C, аэробные	Рост, желтый
				óñë-èÿ,1äåíü
	ÑLED àãàð	P. mirabilis	29245	35°C, аэробные	Рост ползуч.,
				óñë-èÿ,1äåíü	голубой
	ÑLED àãàð	S. aureus	25923	35°C, аэробные	Рост, желтый
				óñë-èÿ,1äåíü

рен, если при посеве петлей с объемом 1 мкл, число КОЕ/л не менее 107 (об ращаем внимание, что это зависит от точности объема жидкости в петле). Стати стически недостоверным считается наличие 2 3 колоний, если концентрация бак терий в них близка к нижним пределам, но в рутинной практике, это принимается.

Культивирование Количественное культивирование проводят на таком от носительно неселективном агаре как CLED (существуют различные аналоги этого агара). Также рекомендуется параллельный посев на кровяной агар. Ин кубация в течение 24 час достаточна, но не оптимальна. В случае, если инфекция вызвана требовательными бактериями или смешанными культурами, результаты будут менее достоверны. Посев на одну чашку 4 различных проб может привести к контаминации и проблемами с оценкой результатов. Однако этот способ кажет ся привлекательным для крупных лабораторий с большим объемом анализов.

Неясности, которые могут возникнуть во время рутинных исследований, следует разрешать при помощи сравнительного метода. Параллельный посев на кровяной агар и инкубация в атмосфере СО2 в течение 2 дней приведет к улуч шению результатов исследований, как в области чувствительности, так и специ фичности. В зависимости от успешности этих дополнительных исследований рутинный метод может быть отнесен к количественному методу исследования второй уровень или к простому экспресс методу (1 уровень)

Метод бактериологического исследования мочи (уровень 3)

Питательные среды:

СLED агар (цистин лактозо электролит дефицитный);

145

К оличественная интерпретация роста

Таблица 5.4

	Объем пробы	Число колоний	Колоний в моче	Колоний в моче
		в чашке	ÊÎÅ/ë	ÊÎÅ/ìë
		1	106	103
	1 ìêë	10	107	104
		100	108	105
		1	105	102
	10 ìêë	10	106	103
		100	107	104
		1	104	101
	100 ìêë	10	105	102
		100	106	103

Кровяной агар; Агар с гематином.

Для более точной идентификации дрожжей требуются специальные мето ды. Контрольные штаммы представлены в табл. 5.3.

Посев.

Вариант А.

Мочу в количестве 10 микролитров наносят при помощи микропипетки на середину чашки с агар гематином и чашки с кровяным агаром, одновременно при помощи 1 мкл пластиковой или платиновой петли проба наносят на СLED агар. В случае, если проба мочи берется посредством надлобковой пункции, то для нанесения на кровяной и гематиновый агары требуется больший объем (100 мкл). Разные объемы исследуемой пробы приводят к разным интерпретациям количественного роста колоний. (табл. 5.4)

Каплю пробы, при помощи петли, распределяют далее штрихами по поверх ности агара сначала вверх вниз, только в середине, в области самой капле, а затем штрихами перпендикулярными предыдущему направлению, эти последу ющие штрихи, наносят часто, очень близко друг к другу. Количественную оцен ка производят в чашках, на агаре которых пробу наносили при помощи микропи петки. В чашки, которые не используются для количественной оценки можно сеять по две пробы.

Вариант Б.

Вариант используют в случае, если требуется более точная количественная оценка. Пробу разводят в соотношении 1:10 в буферном растворе; затем 100 мкл разведения засевают при помощи шпателя Дрыгальского и вращающейся плат формы (1 или 10 мкл может быть недостаточно точно для обычной пипетки). Для учета колоний на чашках, необходимо осуществить посев не менее 3 разве дений. Первоначальные концентрации определяют пересчетом концентраций, полученных при посеве разведений (рис. 5.1)

Для того чтобы повысить точность оценки концентрации бактерий, число повторений должно быть увеличено до 10 20. При определении окончательных результатов используют формулу Пуанссона.

146

Рис. 1. Серийные разведения для подсчета содержания бактерий

Время инкубации Рекомендуем следующие условия для инкубации инкубации:

CLED агар	35 370	С, аэробные условия,	1+1 день
Кровяной агар	35 370	С, анэробные условия, 2 дня
Гематиновый агар	35 370	С, 5% СО2,	1+1 день

Рутинный метод посева мочи при помощи петли.

Существуют методы исследования, которые не отличаются высокой точнос тью, но вполне информативны. Имеется высокий спрос на анализы быстрые и одновременно менее дорогие и это оправдывает существование методик, требу ющих минимальных диагностических манипуляций. Самое низкое содержание бактерий, которое статистически достоверно при этом методе равно 107 КОЕ/л (104 КОЕ/мл)

Питательные среды: СLED (цистин лактозо электролит дефицитный) агар (для контрольных штаммов, табл. 5.3); кровяной агар.

Посев 1 микролитр инокулируется при помощи пластиковой или платиновой петли на кровяной агар и CLED агар. Посевной материал распределяют анало гичным образом, как это было описано выше.

Условия инкубации и интерпретация

CLED агар	35 370	С, аэробные усл ия, 1+1 день
Кровяной агар	35 370	С, СО , 1+1 день
		2

Через 24 часа уже ясно видны результаты посева: отсутствие роста или наличие первичных патогенов (108 КОЕ/л). Морфология колоний может быть оценена на следующий день инкубации (если посев на кровяной агар не прово дят, то в атмосферу 5% СО2 можно поместить чашку со CLED агаром). Это

147

облегчает идентификацию смешанной флоры, которая может состоять из более устойчивых видов бактерий или их вариантов. Увеличение числа видимых коло ний на 8 10% на второй день по сравнению с первым считается значимым.

Как альтернатива CLED агару на рынке существует несколько новых хро могенных питательных сред. Они позволяют прямо идентифицировать E. coli, Proteus/Morganella/Providencia и энтерококки. Используя соответствующую питательную среду также можно идентифицировать S. saprophyticus. Аэробное инкубация при температуре 35 370 С рекомендована для всех сред. Пробы мочи, в которой при исследовании под микроскопом обнаружены дрожжи, необходи мо посеять на хромогенную питательную среду, которая предназначена для вы ращивания дрожжей и позволяет сразу идентифицировать культуры Candida albicans, C. tropicalis и C. krusei.

Исследование при помощи пластиковых тест полосок.

Оборудование. Инкубатор 35 370 С (термометр). Сравнительная таблица для интерпретации. Слайд тесты.

Процедура.

1.Проверьте срок годности, указанный на полоске.

2.Маркируйте полоску. Откройте полоску, не касаясь поверхностей, на которые нанесен агар. Убедитесь, что поверхность с агаром имеет влажный блеск, края и углы не высушены и не сморщены. Пробирка не должна быть влажной.

3.Опустите полоску в сосуд с мочой и смочите около 75% поверхности с агаром. Если уровень пробы в пробирке не позволяет смочить необходимую пло щадь слайда, то покапайте на полоску сверху.

4.Позвольте стечь избытку мочи со слайда и положите полоску нижним краем на чистую фильтровальную бумагу

5.Поместите полоску назад в пробирку и плотно закройте.

6.Инкубируйте при 35 370 С в течение 18 24 часов.

7.Если следующий день приходится на выходные и интерпретировать после указанного периода нет возможности, пробирка помещается в инкубатор до того времени, когда лаборант остается на работе. Перед уходом на выходные про бирку вынимают и хранят до понедельника при 200 С. Культивирование в тече ние 2 3 дней при 200 С сравнительно равноценно культивированию в течение суток при 35 370.

8.Храните изначальную пробу мочи в холодильнике. В случае, если в даль нейшем будет необходимо сделать посевы на чувствительность и оценить ре зультаты, то уместно посылать для дальнейших исследований вместе со слайдом проба первоначальной мочи. Образцы мочи, посылаемые для этого анализа, сле дует транспортировать в холодильнике.

Интерпретация результатов Концентрация колоний. Содержание бактерий интерпретируется по зеле

ной стороне слайда (CLED агар), поскольку она не содержит антимикробных веществ. Рост бактерий может быть выражен в образовании как очень малень

148

ких, так и больших колоний. Высокое содержание бактерий проявляется слия нием колоний. Интерпретация упрощается, если смочено лишь 75% поверхнос ти слайда, потому что в этом случае остается достаточно чистой поверхности для сравнения. Очень помогает в этом случае увеличительное стекло (12 х), так как маленькие колонии трудно отличить от кристаллов, если наблюдать результаты невооруженным глазом

Памятка. Не забывайте использовать одни и те же объемные единицы (л или мл)

Смешанная флора. Помните о различной форме, размерах и цвете колоний. Присутствие нескольких видов бактерий, обычно свидетельствует о контамина ции пробы во время забора. Используйте увеличительное стекло!

Рост E. coli

На селективном агаре E. coli появляется в виде коричневых или черных ко лоний. E. coli обычно ферментирует лактозу (>90%) Штаммы, не ферменти рующие лактозу, которые образуют коричневые или черные колонии на E. coli селективном агаре также считаются как E. coli.

					Оценка роста
		Условное количество
	Вариант по сравнению с контрольной				Интерпретация
			таблицей
	1		< 106	ÊÎÅ/ë	Нет роста
		(< 103 ÊÎÅ/ìë)
	2		< 107	ÊÎÅ/ë	Отрицательный результат
		(< 104	ÊÎÅ/ìë) íå E. coli
	3		> 106	ÊÎÅ/ë	Положительный результат
		(>103 ÊÎÅ/ìë) E. coli
	4		> 107	ÊÎÅ/ë	Мочу и слайд отсылают для дальнейшего
		(> 104	ÊÎÅ/ìë) íå E. coli		микробиологического исследования
	5	Смешанная флора			Отрицательный результат
		(нет концентрации)
	6	Смешанная флора + E. coli			Рекомендовано повторное исследование
		(нет концентрации)

Оценка.

Результаты вариантов 1, 2 и 5 следует считать отрицательными. Результаты 4 и 6 могут считаться как положительными, так и отрицательными; в этом слу чае и мочу и слайд следует отослать для дальнейшего исследования, чтобы иден тифицировать патогены и, если возникнет необходимость, провести тесты на чувствительность. Результат варианта 3 следует считать положительным

Идентификация вида уропатогенов. (Уровень 2)

Предлагаемая методика идентификации вида возбудителей инфекций моче выводящих путей базируется на культивировании микроорганизмов на СLED и кровяном агарах. Цель установить минимальные критерии для достижения по ложительных результатов и дополнительно, критерии идентификации патогена.

149

Нетребовательные микроорганизмы А. Грамположительные микроорганизмы.

Staphylococcus spp. Грамположительные, каталазаположительные грозди кокков. Обычно разделяют на 3 группы:

S. saprophyticus

S. aureus

Другие коагулазаотрицательные стафилококки (КОС)

1.S. saprophyticus. Минимальные критерии: ДНК аза отрицательные*, ус тойчивы к новобиоцину, зона < 16мм, диск 5mg; типичные колонии от фарфо рового до цвета слоновой кости на кровяном агаре, желтоватые на СLED агаре; коагулазаотрицательные**; часто чувствительны к ампициллину, цефалоспори нам и триметоприму, мецилинорезистентны in vitro; штаммы с различной устой чивостью следует дальше типировать, прежде чем идентифицировать их как S. saprophyticus.

Примечание: * – тест на ДНКазу рекоммендовано проводить при иссле довании изолятов мочи; латекс агглютинация менее уместна, так как S. saprophyticus часто вызывает агглютинацию. Некоторые КОС образуют ДНКа зу. На практике колонию субкультивируют на кровяном агаре с новобиоцино вым диском и на ДНК агаре; ** – коагулазный тест должен быть проведен с плазмой кролика, если тесты с ДНКзой или агглютинация дают неопределен ные результаты.

2.S. aureus. Минимальные критерии: каталазаположительные, ДНК аза положительный или S. aureus агглютинация положительный; морфология коло ний: колонии крупнее и более одинаковы по размеру, нежели у КОС, часто жел того оттенка на кровяном агаре и на СLED агаре; каталазаположительные (ме тод **).

3.Другие КОС: стафилококки, которые не отвечают критериям, перечис ленным в пунктах 1 и 2. образуют белые или желтые колонии на кровяном и на СLED агарах.

Enterococcus spp. и Streptococci. Цепочки грамположительных кокков.

Enterococcus spp. Минимальные критерии: положительная проба на желч но эскулиновом агаре, агглютинация сывороткой группы Д; растет на бульоне с 6.5% NaCl; серовато белые колонии на кровяном агаре, могут не давать гемо лиз, давать альфа гемолиз или бета гемолиз, обычно желтые колонии на СLED агаре; ферментация арабинозой используется для дифференциации Enterococcus faecium (положительная) от Enterococcus faecalis (отрицательная); маленькая чувствительность к цефалоспоринам (можно использовать для того, чтобы от личить энтерококки от стрептококков группы В, если САМР тест обычная про цедура).

Стрептококки группы В. Минимальные критерии: агглютинация сыворот кой группы В, положительный САМР тест; маленькие бесцветные колонии на СLED агаре, которые иногда можно наблюдать на второй день инкубации. На кровяном агаре – серо бело голубые колонии с узкими зонами альфа гемолиза, бета гемолиза или гемолиза; чувствительны к цефалоспоринам.

150