Tec_V_V_Mikroorganizmue_i_antibiotiki_Zaboleva_BookFi_org

Другие бета гемолитические стрептококки. Минимальные критерии: бета гемолиз, агглютинация с каждой группой; часто плохой рост на СLED ага ре, бета гемолиз на кровяном.

α стрептококки. Минимальные критерии: гемолиз, грамположительные кокки в цепочках; на СLED агаре колонии маленькие или совсем отсутствуют, на кровяном агаре – альфа гемолиз; оптохиновый тест (ориентировачный тест) ≤ 14 мм.

Lactobacillus spp. Минимальные критерии: грамположительные палочки, выглядят типично, каталазаотрицательные; на СLED агаре колонии маленькие или совсем отсутствуют, иногда лактозаположительные; на кровяном – альфа гемолиз; микроскопия: грамположительные (иногда грамвариабельные), корот кие или длиные, нормальные палочки.

Вacillus spp. Минимальные критерии: Грамположительные палочки; часто большие сухие колонии с гемолизом на кровяном агаре; часто смешаны с Enterobacteriaceae или Pseudomonas; каталаза положительные, оксидаза поло жительные/отрицательные; микроскопия: нормальные, большие, грамположи тельные или грамвариабельные палочки, иногда с видимыми спорами.

Corynebacterium urealyticum. Минимальные критерии: грамположитель ные палочки, каталаза положительные, быстрый уреазный тест. Если остаются сомнения, то для подтверждения диагноза обратитесь к базе данных системы API; медленный рост, маленькие блестящие колонии на кровяном агаре; часто очень устойчивы к антибиотикам.

Дифтероидные палочки. Минимальные критерии: грампожительные па лочки характерного вида; слабый рост на СLED агаре; микроскопия: грамполо жительные палочки конической формы, расположенные в виде столбиков; ката лаза положительные.

Наличие Corynebacterium urealyticum можно установить при помощи уре азного теста.

Обратите внимание на то, что описанные выше критерии не исключают бак терии рода Listeria

Б. Грамотрицательные бактерии Enterobacteriaceae. Ниже предлагается простая схема идентификации вида

микроорганизма, выделенного из проб мочи.

Основные критерии: грамотрицательные палочки, ферментирующие глюко зу, оксидаза отрицательны по Ковачу, хороший рост на агаре МакКонки. Для более детальных рекомендаций смотрите руководство для Enterobacteriaceae.

Минимальные критерии: 4 теста: лактоза, Фогес Проскауэр (VP) тест, ONPG тест на бета галактозу, индол (реактив DMACA); альтернативно – тест с пара диметиламино бензальдегидом по Ковачу или Эрлиху.

Лактоза положительный рост на СLED агаре 1. Морфология колоний указывает на E.coli

Провести тест на индол на кровяном агаре

Если тест на индол – положителен, это E.coli, если отрицателен, то это указывает на грамотрицательные палочки Enterobacteriaceae и нужно поста

151

вить VP тест (при положительном VP тесте и отрицательном индоле = Klebsiella/ Enterobacter; при отрицательном VP тесте и отрицательном индоле = грамотрицательные палочки Enterobacteriaceae).

2. Морфология колоний указывает на Klebsiella/ Enterobacter

Поставить VP тест и тест на индол (при положительном VP тесте и положительно/отрицательном индоле = Klebsiella/ Enterobacter)

при отрицательном VP тесте и отрицательном индоле = грамотрицатель ные палочки Enterobacteriaceae

при отрицательном VP тесте и положительном индоле = E.coli 3. При положительной І глюкуронидазе = E.coli Неферментирующие глюкозу грамотрицательные палочки

Основные критерии: хороший рост на агаре МакКонки, оксидаза положи тельные по Ковачу (см. на исключения указанные ниже), неферментирующие глюкозу (отрицательные пробы на Клиглера агаре (КIА) или трехсахарном ага ре (TSIA).

Определение до вида рутинно проводится для Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophila и Acinetobacter остальные изоляты отмечаются, как: “грамотрицательные палочки, не Enterobacteriaceae”

Pseudomonas aeruginosa. Минимальные критерии:

1.Сразу может быть отмечен характерный запах и вид (буро зеленый цвет, клубничный или фруктовый запах); оксидаза положительна по Ковачу.

2.Проба на алкоголь дегидрогеназу (ADH) положительна, рост при тем пературе 420 С.

Когда не ферментирующие глюкозу грамотрицательные палочки тестируют на декарбоксилазу, очень уместно иметь как положительный, так и отрицатель ный контроли, поскольку результаты теста очень трудно интерпретировать. P. аeruginosa ADH положительна и LDC (лизин декарбоксилаза) отрицательна.

Stenotrophomonas maltophilia. Минимальные критерии: после двух дней ти пичная морфология колоний, не ферментирующие, оксидаза отрицательные, ДНКаза положительные.

Характерный вид колоний и запах аммония при росте на кровяном агареМикроскопия: грамотрицательные узкие палочки.

Acinetobacter. Минимальные критерии: типичная морфология колоний, не ферментирующие, оксидаза отрицательные.

ДНКаза отрицательные, микроскопия: грамотрицательные палочки, пе реходящие в кокки.

Дрожжи. Минимальные критерии: типичная морфология колоний, микро скопия: грибы.

Выпуклые сухие колонии с гладкими краями (после долгой инкубации иногда принимают форму звезд), запах дрожжей при мощном росте.

Микроскопия: грамположительные большие овальные клетки, иногда с почкованием

Положительный тест с сывороткой = Candida albicans

Отрицательный тест с сывороткой = неспецифические дрожжи

152

Дальнейшее типирование под

начало

окончание

твердит, вызваны ли клинические

проявления инфекции Cryptococcus

neoformans или другими грибами.

Методы микроскопии в

микробиологии

Слайд центрифугирование.

(Уровень 3)

Недостатком этого хорошего и

надежного метода является его тру

Рис. 5.2. Предлагаемый образец для

дозатратность, поэтому чаще его ис

пользуют для количественного оп

исследования 12 иммерсионных полей.

ределения.

Процедура:

1. 200 мкл тщательно смешанной пробы капают при помощи пипетки в ка меру слайд центрифуги, и центрифугируют со скоростью 2000 g в течение 5 минут.

Методы идентификации уропатогенной флоры1

Таблица 5.5

Вид исследований	ASM 5 èçä.	ASM 6 èçä.	ASM 7 èçä.
CAMP òåñò	250	303	287
ДНКаза тест	1243
Желчно-эскулиновый Агар	1230	303	298, 1690
Окраска по Граму	1306		1677
Агар Клиглера (KIA)	1255
NaCl бульон	1273	308-11	298
трехсахарный агар (TSIA)	1279
Тест на индол по Ковачу2	1295		1668
Тест на индол по Эрлиху2			1668
Тест на индол2	1294		1668
Тест на каталазу	1290		1666
Тест на коагулазу	1292	288-9	1666
Ортохин тест	249, 1222	303	288
Тест на оксидазу по Ковачу	1295		1670
Тест с сывороткой	620	727-8	1189
Фогес-Проскауэр тест	1302		1672

Примечание: 1 – указаны номера страниц Учебников по Клинической Микробиологии, изданных AMS (Американское общество микробиологов) в разные годы, на которых можно найти детальное описание перечисленных тестов (5 издание – 1991г, 6 издание – 1995 и 7 издание – 1999); 2 – в тестах на индол к кровяному агару необходимо добавлять Л-триптофан (10 мл 1% Л-триптофана на 1 л агара). Тесты на индол до лжны пр ов о дить ся с р е а ктив о м D MA C A (п-диметиламино - циннамальдегид), поскольку это самый чувствительный метод.

153

Ðекомендуемая последовательность идентификации бактерий

ïри методе центрифугирования

Таблица 5.6

	Ступень		Содержание
		Отрицательно	Несколько	Умеренно	Изобилие
	Наблюде-	Ни одной	Одинаковый	Одинаковый	> 100
		бактерии ни в	морфологический	морфологический	организмов в 12
	íèå	одном из полей	тип в < 6 полях	тип в ? 6 полях	полях

Реактивы Кристаллический фиолетовый, исходный спиртовой раствор, приготовленный из

расчета: 100 г вещества растворены в 750 мл 96% этилового спирта (огнеопасно!) Аммония оксалат моногидрат 1%

100 мл готового раствора генциан-фиолетового

Используемый раствор: 500 мл раствора аммония оксалата 400 мл воды (отвечающей требованиям, необходимым

для лабораторных исследований)

После приготовления отфильтровать, хранить при температуре +200 Ñ

	Кристаллы йода высокой очистки		1ã
Раствор Люголя:	Йодид калия		2ã
	Âîäà		300 ìë
Растворить кристаллы йода и калия йодида в воде. Не автоклавировать.
Хранить в темной бутылке при температуре +200 Ñ
Растворитель:
Ацетон высокой очистки			20 ìë
Этиловый спирт 96 %			80 ìë
Хранить при температуре +200 С. Очень огнеопасно!
		Фуксин		8 ã
Раствор для контрастной окраски		Этиловый спирт 90%		92 ã
Карбол фуксин исходный раствор:		Фенол 90%		50 ã
		Âîäà		äî 1 ë
	Может храниться до 3 лет
Рабочий раствор		Исходный раствор		10 ìë
		Âîäà		90 ìë

Хранить при температуре +200 Ñ

Начиная от центра пятна последовательно сканируют с масляной иммерсии 12 полей от каждой пробы (рис. 5.2). Результаты представлены в табл. 5.4.

Окрашивание по Граму.

Фиксация.

Тщательно ресуспендировать мочу или использовать образец из бактери альной культуры. Возьмите 1 каплю мочи и распределите ее на стекле площадью 1х2см. Высушите стекло на воздухе. Зафиксируйте в пламени. Можно также зафиксировать добавлением нескольких капель метанола и оставить на 2 мин, позволить метанолу испариться и мазку еще высохнуть.

Окрашивание.

Окрасить кристаллическим фиолетовым мазок, оставить на 30 сек, смыть краску, ополоснуть раствором Люголя, оставить на 60 сек. Растворить краску

154

Степени концентрации бактерии при окрашивании по Граму

Таблица 5.7

Степень	Отриц.	1+	2+	3+
Бактерии в иммерсионном поле		1	1-5	>5

ацетон этанолом. Покрасить карбол фуксином в течение 15 сек, ополоснуть ос торожно водопроводной водой. Высушить на воздухе или использовать для сушки другие коммерческие средства.

Микроскопировать мазок с маслянной иммерсией с объективом х100 (уве личение х1000 с х10 окулярами)

Грамположительные организмы окрашиваются в голубой или фиолетовый цвета, грамотрицательные – красный. Интерпретация мазков, окрашенных по Граму, требует опыта и не может быть рекомендована для отдельных наблюде ний.

Просмотрите минимум 5 полей и запишите среднее наличие элементов в каж дом поле в соответствии с табл. 5.7.

Метод микротитрования (Уровень 1)

Определенный объем мочи помещают в лунку 96 луночного планшета с плос кими донышками, и оставляют на 5 мин. Затем лунка наблюдается под инверти рованным микроскопом. Присутствие или отсутствие белых телец, красных те лец и бактерий отмечают на шкале. Наблюдение требует операторских навыков, так как бывает трудно отличить кокки от бесформенных частиц. Не все лабора тории обеспечены одноразовыми 96 луночными планшетами, однако возможно дезинфицировать их в холоде, тщательно вымыть и высушить, чтобы использо вать повторно. Метод также можно использовать для обнаружения дрожжей, что очень важно при идентификации патогенов, а также для обнаружения S.haematobium, и неважно подозревалось ее наличие или нет.

Обратите внимание на то, что этот метод используется, чтобы однозначно определить инфицирована моча или нет, чтобы облегчить работу лаборатории, для более детального анализа.

Процедура.

1.Осторожно переверните сосуд с первичной мочой, наберите пипеткой 60 мкл в лунку, скоординируйте лунку.

2.Дайте возможность оформленным элементам отстояться в течение 5 мин

Ïредлагаемая схема оценки мочи при методе микротитрования

Таблица 5.8

	Степень	Отриц.	1+	2+	3+
	Лейкоциты / поле высокого	1–10	11–50	50–200	>200
	разрешения
	Эритроциты / поле высокого	1–10	11–50	50–200	>200
	разрешения
	% поля высокого разрешения,	<10%	10–30%	30–60%	>60% äî
	«загрязненный» бактериями				слияния

155

3.Поместите планшет под микроскоп и сделайте микроскопию донышка лунки, используя х20 объектив и освещение средней интенсивности, позволяю щие максимально улучшить условия микроскопии бактерий.

4.Отметьте присутствие лейкоцитов и красных телец в представительном поле уже после того, как Вы убедились в их наличии во всей лунке.

5.Отметьте наличие бактерий и оцените в поле большого увеличения, в со ответствии с табл. 5.8

По материалам статьи:

ЕСLM European Urinalysis Group European Urinalysis Guidelines Ed. By T. Kouri, G Fogazzi, V Gant, H. Hallander, W. Hofmann and W.G. Guder The Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation 2000, vol. 60, no. Supplement 231, pp. 1 96(96).

156

СТАНДАРТИЗАЦИЯ РУЧНЫХ МЕТОДОВ РУТИННОГО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ

1. Доставка образцов. Микроскопическое исследование

Для забора и транспортировки материала в лабораторию используют транспортную среду – Portagerm Amies Agar + Swab (Портагерм). Каждый набор содержит упакованные вместе пластиковую пробирку со сте рильной транспортной средой и пробирку, содержащую стерильный ватный ап пликатор. Забор материала производится аппликатором, во избежание конта минации наконечник аппликатора должен лишь коснуться предполагаемого оча га инфекции. Затем аппликатор помещают в пробирку со средой и транспорти руют в лабораторию для исследования. Среда Портагерм идеальна для поддер жания жизнеспособности большинства клинически значимых видов микроорга низмов в течение 24 48 часов. Требовательные микроорганизмы, такие как

Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae и анаэробы должны быть пере сеяны на чашку в течение 24 часов

· Окраска по Граму (набор)

2. Культивирование

Посевы можно осуществлять на уже готовые к использованию чашки, во флаконы, пробирки с селективной средой и специально обогащенным агаром. Также можно использовать сухие среды и поставляемые отдельно ингибирую щие и обогащающие добавки.

Первичный посев может осуществляться на следующие среды:

·Селективную среду для дрожжей

·Шоколадный агар

·Колумбия CNA агар обогащенный

·Мак Конки агар

·CPS ID 3 агар Среда для выделения и количественного учета бактерий, вызываю щих инфекции мочевого тракта, а также для непосредственной идентификации бактерий, наиболее часто встречающихся при данной патологии: Escherichia coli, Enterococcus, KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter), Proteus, Providencia, Morganella.

·Candida ID 2. Хромогенная селективная среда для выделения дрожжей и непосредственной идентификации Candida albicans и предварительной диффе ренциации группы видов, включающей C. tropicalis, C. lusitaniae и C. kefyr.

·Обогатительная смесь Поливайтекс. Обогатительная добавка для пита тельных сред. Дополнительный компонент шоколадного агара. Применяется для выделения и культивирования прихотливых микроорганизмов, в частности, в

157

сочетании с селективной смесью VCN, для выделения и культивирования патогенных нейссерий.

3. Идентификация

Ориентировочная идентификация мо жет быть произведена на системах Slidex.

Системы идентификации и диагностики Slidex основаны на методе быстрой агглютинации с использованием антител, адсорбированных на латексных части цах. Система позволяет эффективно идентифицировать выделенный микроб или определять наличие возбудителя в материале, полученном от больного. Для по становки реакции на пластину наносят по 1 капле реактивов латекса и отрица тельного контроля и добавляют материал от больного или культуру (1 2 коло нии).

Считывание результатов и их интерпретацию производят через несколько минут (наличие или отсутствие агглютинации) .

Идентификация также проводится на ручных стрипах:

	Стрип		Назначение
			Идентификация Enterobacteriaceae
	API 20 E		и других грамотрицательных палочек
			(наиболее клинически значимых неферментирующих организмов)
	API 20	NE	Идентификация неферментирующих грамотрицательных палочек
	API Staph		Идентификация Staphylococcus, Kocuria, Micrococcus
	API 20	Strep	Идентификация Streptococcaceae
			и родственных микроорганизмов
	API 20	NH	Идентификация Neisseria, Haemophilus;
			определение биотипа H. influenzae и H. parainfluenzae
	API 20 C AUX		Идентификация дрожжей родов Candida, Cryptococcus,
			Trichosporon, Rhodotorula, Saccharomyces
	API Candida		Идентификация дрожжей рода Candida
	API 50	CHL	Идентификация лактобацилл и родственных родов;
			стрип API 50 CH + среда API CHL

Тест система представляет собой биохимический ряд: планшету, в лунки ко торой внесены ферментативные субстраты и сахара (а также другие утилизиру емые субстраты). Суспензия идентифицируемого организма на основе дистил лированной воды, физиологического раствора или минимальной среды вносится в лунки стрипа. Учет результата производится через 18 24 часа по изменению цвета индикатора. Идентификация осуществляется по полученному биохими

158

ческому профилю с помощью индекса профилей (вручную), или специального программного обеспечения (на CD диске или on line).

4. Определение чувствительности к антибиотикам

Метод биодисков:

·Среда Мюллер Хинтон (Флаконы и чашки)

·Диски с антибиотиками

Исследование мочи

На сегодняшний день широкое распространение получают системы, в кото рых посев осуществляется путем погружения пластинки со средой в сосуд с мо чой. К таким системам относятся: Uriline и Uriline 3 coli.

Uriline пластинки опускают в свежесобранную мочу для определения в ней количества бактерий. Делать это нужно не позднее, чем через час после забора материала. Пластинка состоит из пластмассового основания, покрытого с каж дой стороны питательной средой, и предохраняющей пластмассовой пробирки. Одна сторона покрыта агаром CLED (электролитно дефицитный агар с цисти ном и лактозой) зеленого цвета, предназначен для определения микробного чис ла и дифференциации бактерий, сбраживающих и не сбраживающих лактозу. Низкая концентрация электролитов в среде предотвращает расползание коло ний Proteus spp.. Вторая сторона покрыта модифицированным агаром МакКон ки. В состав среды входят соли желчных кислот и кристаллический фиолетовый, которые ингибируют рост грамположительных бактерий. После погружения пластинки в пробу дают стечь избытку мочи с агара, возвращают пластинку в ее пробирку и инкубируют в вертикальном положении 16–24 часа при 36°С. За тем достают пластинку и сравнивают плотность колоний на поверхности агара CLED со схемой, указывающей на соответствие плотности количеству бакте рий в 1 мл мочи. Пластинки Uriline 3 coli отличаются от вышеописанных тем, что на одну из сторон вместе с агаром МакКонки нанесена среда для идентифи кации Escherichia coli. На этой среде колонии кишечной палочки окрашиваются в коричневый цвет, что видно невооруженным глазом. Колонии других грамот рицательных микроорганизмов остаются бесцветными.

Диагностика кандидоза

Для диагностики кандидоза можно использовать агаризированные пластинки Mycoline. Пластинки предназначены для транспортировки и культивирования дрожжей и дерматофитов. Каждая пластинка заключена в воздухонепроницае мую пластиковую пробирку. Одна сторона пластинки покрыта средой Сабуро с гентамицином и хлорамфениколом для селективного выделения дрожжей, плес невых грибов и дерматофитов, вторая – средой Сабуро с хлорамфениколом и актидионом для селективного выделения дерматофитов. Материал со слизис тых оболочек равномерно распределяют по обеим сторонам пластинки, начиная со стороны 1, пластинку помещают в пробирку и инкубируют при 28 30 С в течение 24 48 часов с приоткрытой крышкой, после чего производят учет ре зультатов.

159

АВТОМАТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ

Идентифицировать возбудитель и определить его чувствительность к анти биотикам можно с помощью различных приборов. Представителем нового по коления автоматических анализаторов является VITEK 2 Compact.

В комплект оборудования входят: анализатор VITEK 2 Compact, компью тер (рабочая станция), принтер, денситометр, пипетки, диспенсер для дозирова ния физиологического раствора. Расходные материалы: карты для идентифика ции и для определения чувствительности к антибиотикам. Карты состоят из яче ек, соединенных микрокапиллярами и заполненных лиофилизированными суб стратами, и имеют трубочку для контакта с пробиркой, содержащей суспензию микроорганизма.

Из выращенной на обычной среде (не селективной) чистой культуры, при помощи денситометра (измерение плотности суспензии в ед. МакФарланда) готовят стандартизированную бактериальную суспензию. Затем пробирку с сус пензией и карту помещают в кассету. Далее кассету помещают в вакуумную стан цию, где происходит заполнение карт суспензией. Под действием вакуума воз дух выходит из карты. При возвращении атмосферного давления к нормально му суспензия под давлением воздуха засасывается в карту и по микрокапилля рам распределяется по лункам. После этого содержимое лунок не перемешива ется, т.к. капилляры достаточно тонкие, что обеспечивает герметичность каждой лунки при нормальном давлении. Далее кассету с заполненными картами поме щают в модуль для загрузки. Там происходит автоматическое считывание штрих кода, запаивание карт и их загрузка в инкубатор, где они инкубируются при температуре 35.5°С.

Считывание каждой карты происходит каждые 15 минут. При этом для каж дой лунки делается 16 измерений.

Имеется две оптических системы :

–колориметрическая (измерение длины волны проходящего света),

–турбидиметрическая (измерение мутности).

Длительность инкубации:

– идентификация бактерий: 2 10 часов, в среднем 6 8 часов

160