5. Методика постановки реакции связывания комплемента при бруцеллезе

Реакцию ставят в водяной бане в общем объёме 2,5 см³ всех компонентов при 37.—38° С.

Компоненты реакции

а) гемолнзин— рабочий титр не менее 1 :1 000;

б) бруцеллёзный антиген-экстракт бруцеллёзных микробов (в титре, установленном учреждением, изготовившим его);

в) комплемент—свежая или консервированная сыворотка морской свинки;

г) испытуемая сыворотка и сыворотка нормальная и бруцеллёзная для титрации комплемента в бактериологической, системе, инактивированные в день постановки реакции;

д) 2,5% взвесь эритроцитов барана от осадка на физиологическом растворе (1 :40);

е) физиологический раствор 0,85 о/о химически чистой поваренной соли в дестиллированной воде.

Титрация компонентов реакции

Перед постановкой реакции производят подтитровку, компонентов её: гемолизина, бруцеллёзного антигена и комплемента в гемолитической и бактериологической системах.

Титрация гемолизина

Гемолизин титруют в следующих разведениях—из основного разведения 1:100 готовят разведения гемолизнна 1:500; 1:1000; 1:1500; 1:2000; 1 :2500; 1 :3 000; 1:3500 и т. д.

Выпускаемый биофабриками гемолизин консервируют 1 :1 глицерином. Поэтому при приготовлении основного разведения 1 :100 берут 0,2 гемолизина и 9,8 физиологического раствора. При консервировании комплемента фенолом разведение его 1 :100 получается при взятии 0,1 комплемента на 9,9 физиологического раствора.

Комплемент входит в реакцию в разведении 1 :20 по 0,5 см⁸, эритроциты барана—в 2,5 % взвеси из осадка по 0,5 см³. Взамен бруцеллёзного антигена и сыворотки в пробирки прибавляют по 1 см³ физиологического раствора. Продолжительность реакции - 10 минут в водяной бане при 37—38° С.

Титром гемолизина считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см³ взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см³ в разведении 1 :20.

В качестве рабочей дозы гемолизина для дальнейших титрации комплемента, бруцеллёзного антигена, а также для реакции по испытанию подозрительных по бруцеллёзу сывороток животных (в главном опыте) берут удвоенный титр гемолизина. Например, если титр гемолизина при его подтитровке был равен 1 :2 000, то в главном опыте берут разведение его 1 :1 000.

При титрации гемолизина ставят следующие контроли:

а) контроль гемолизина (т. е. гемолизин 1 :10 +эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии комплемента);

б) контроль комплемента (т. е. комплемент +эритроцщты +физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии гемолизина);

в) контроль физиологического раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии гемолизина и комплемента).

Во всех указанных контролях гемолизин эритроцитов должен отсутствовать.

Титрация комплемента в гемолитической системе

Комплемент исследуется в дозах: 0,1; 0,13; 0,16; 0,19 и т. д. с интервалом в дозировке по 0,03 до 0,49 комплемента в разведении 1:20. В каждую пробирку недостающее до 0,5 количество разведённого комплемента доливают физиологическим раствором

Схема титрации комплемента в гемолитической системе

Комплемент в разведении 1:20	0,1	0,13	0,16	0,19	0,22	0,25	0,28	0,31	0,34	0,37	0,40	0,43	0,46	0,49
Недостающее количество фи-зиологического раствора........ Эритроциты барана из разве-дения 1:40............................. Гемолизии в рабочем титре... Физиологический раствор вместо антигена и сыворотки..	0,40 0,5 0,5 1,0	0,37 0,5 0,5 1,0	0,34 0,5 0,5 1,0	0,31 0,5 0,5 1,0	0,28 0,5 0,5 1,0	0,25 0,5 0,5 1,0	0,22 0,5 0,5 1,0	0,19 0,5 0,5 1,0	0,16 0,5 0,5 1,0	0,13 0,5 0,5 1,0	0,1 0,5 0,5 1,0	0,07 0,5 0,5 1,0	0,04 0,5 0,5 1,0	0,01 0,5 0,5 1,0

Водяная баня 10 минут при 37—38° С.

(в первую пробирку 0,4 физиологического раствора, во вторую 0,37 и т. д.).

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см³ взвеси эритроцитов при вытитрованной рабочей дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38° С.