Титрация комплемента в бактериологической системе

Компоненты: сапные сыворотки ++++ и ++, консервированные 5% карболово-физиологическим раствором (на 9,0 сыворотки 1,0 раствора), нормальные сыворотки—2. Сыворотки берут той же давности, что и испытуемые.

Сапные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,05 и добавляют 0,45 физиологического раствора (или делают разведение 1 :10 и разливают по пробиркам по 0,5). Разведение комплемента из основного разведения (1 :20) начинается на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25, то разведение начинается с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Каждое разведение комплемента ставится с контролем без антигена. Во все пробирки до недостающей 0,5 см³ дозы комплемента добавляют физиологический раствор.

После разливки нормальных и сапных сывороток, сапного антигена в титре и соответствующих доз комплемента пробирки ставят на 20 минут и водяную баню при 37°С, после чего в них наливают по 0,5 см³ гемолизина в рабочем титре и 0,5 см³ эритроцитов барана (2,5 о/о взвесь). Время реакции в гемолитической системе—20 минут.

Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками с антигеном и без антигена, и с сапной сывороткой без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в сапной сыворотке с антигеном при 37°С в течение 20 минут.

Разведение комплемента для главного опыта

Допустим, что надо исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3, разведение 1 ; 20. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015, т. е, 0,3 :20 ==0,015.

0,015Х100== 1,5 чистого комплемента и 48,5 физиологического раствора.

Антиген применяют в титре, установленном биофабрикой. При получении новой партии титр проверяется на известных сапных и нормальных сыворотках по приведённой ниже схеме.

Главный опыт

Испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,05. Контроля без антигена в дозе 0,1. Инактивируются сыворотки с физиологическим раствором при 58—59° С 30 минут. Время связывания бактериологической системы в водяной бане—20 минут, реакция—20 минут.

Сыворотки, обнаружившие ту или иную степень задержки гемолиза, проверяются вторично в дозах 0,1 и 0,05, с контролем в дозе 0,1.

При массовых исследованиях разрешается производить первую реакцию, с сывороткой без контроля (сыворотки без антигена).

Основные контроли. главного опыта. 1. Нормальные и сапные сыворотки с аятигеном и без антигена в дозах 0,05.

2. Антиген в двойной дозе без сыворотки.

3. Контроли гемолитической системы.

4. Оценка результатов реакции.

Официальной диагностической дозой сыворотки, по которой даётся результат, является 0,05 см³ для реакции, производящейся в объёме 0,5 см³. Доаа 0,1 см³ является вспомогательно-контрольной. Результат реакции оценивается два раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной темпертуре. Оценка выражается крестами по следующей схеме:

а) положительная реакция ...................................++++ +++ ++±

б) сомнительная » ................................... ++ +

в) отрицательная » ................................... -

Степени задержки, выражаемые крестами, соответствуют следующим процентам гемолиза эритроцитов:

++++ гемолиз эритроцитов ............................от 0 до 10%

+++ » » ............................ » 10 » 40%

++± » » ............................. » 40 » 50%

++ » » .............................. »50 » 70%

+ » » ............................. » 70 » 90%

- » » ..............................» 90 » 100%

Результат исследования сообщается словами: положительная, отрицательная, сомнительная реакция, с указанием количества крестов. Данные всех титрационных опытов и особенностей реакции вносятся в дневник серологических работ лаборатории.

Для внесения объективного признака в определение результата реакции крестами и однообразной оценки её в различных лабораториях, рекомендуется производить оценку в процентах гемолиза. Это делают так: из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость сливают в одну пробирку. Жидкость эта означает 100 о/о гемолиза. Из неё готовят разведения с меньшими процентами гемолиза следующим образом:

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Гемолизированная жидкость	0 2	0 4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8
Физиологмческий раствор ......... Процент гемолиза . . .	1,8 10	1,6 20	1,4 30	1,2 40	1,0 50	0,8 60	0,6 70	0,4 80	0,2 90

Стандартные пробирки приготовляют перед учётом реакции. Учёт производят тогда, когда эритроциты осели на дно пробирки. Цвет исследуемой жидкости сравнивают с цветом жидкости, находящейся над осадком в стандартной пробирке; процент переводят в кресты.

Для более наглядного сопоставления реакции со стандартной жидкостью гемолиза рекомендуется при изготовлении этого стандарта, не изменяя объёма жидкости, в каждую пробирку добавить кровяных шариков барана в разведении 1 :40 по следующей схеме:

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
2,5% взвесь эрит-роцитов .........
	0,45	0,40	0,35	0,30	0,25	0,20	0 15	0,10	0,05
Общий объём гемолизированной жидкости .
	2,05	2,10	2,15	2,20	2,25	2,30	2,35	2,40	2,45