6. Методика постановки реакции связывания комплемента при сапе

Реакция производится в водяной бане при общем объёме 2,5 см³

всех компонентов при 37—38°С.

Компоненты реакции

а) гемолизин—рабочий титр не менее 1 :1 000;

б) сапной антиген—экстракт сапного микроба;

в) свежая или консервированная сыворотка морской свинки (комплемент);

г) испытуемая сыворотка и сыворотки (нормальная и санная) для титрации комплемента в бактериологической системе, инактивпрованные в день постановки реакции при температуре 58.—59°С в течение 30 минут.

д) 2,5 °/о взвесь эритроцитов от осадка в физиологическом растворе (1 :40);

е) физиологический раствор 0,85 °/о химически чистой поваренной соли на дестиллированной воде.

Гемолизин и сапной антиген изготовляют централизованно на биофабриках.

Титрация компонентов реакции

Перед реакцией производят титрацию гемолизина и комплемента в гемолитической системе и комплемента в бактериологической системе.

Титра ция гемолизина

При титраций гемолизина делают следующие разведения: 1 :100; (основное разведение); 1; 500; 1:1 000; 1:1 500; 1:2 000; 1:2 500; 1:3000; 1:3500; 1:4000 и т. д.

Если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берут 0,1 гемолизина на 9,9 физиологического раствора (1:100), если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 см³ гемолизина на 9,8 физиологического раствора (обычно на фабрике и принято консервировать гемолизин глицерином).

Комплемент употребляют в разведении 1 :20 по 0,5 см³ и эритроциты—2,5 °/о взвесь из осадка по 0,5 см³. Взамен сапного антигена и сыворотки лошади в пробирки прибавляют 1 см³ физиологического раствора. Продолжительность реакции—10 минут в водяной бане при 37—38°С. Титр гемолизина—наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 см³ взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 см³ разведения 1 :20- при 37—38° С в течение 10 минут.

Рабочей дозой гемолизина' для дальнейших титраций комплемента и сапного антигена, а также для реакции при испытании подозрительных по сапу сывороток (главного опыта) считается удвоенный титр гемолизина.

При титрации гемолизина ставят следующие контроли: 1) контроль гемолизина (т. е. Гемолизкн 1 :100 + эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии комплемента); 2) комплемента (т.е. комплемент + эритроциты +физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии гемолизина и 3) физиологи-

ческого раствора (т. е. эритроциты + физиологический раствор до объёма 2,5 см³ при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроцитов отсутствует. Для дальнейшей работы допускается смешивание гемолизина и эритроцитов в одинаковых объёмах.

Титрация комплемента в гемолитической системе

Комплемент исследуют в таких дозах; 0,1; 0,13; 0,16; 0,19; 0,22 и т. д. с интервалами по 0,03 до 0,49 комплемента в разведении 1 :20. В каждую пробирку до недостающего количества (объёма) в 0,5 см³ доливают физиологический раствор (в первую пробирку 0,4 см³ физиологического раствора, во вторую—0,37 см³ и т. д.).

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее количество, потребное для полного гемолиза 0,5 см³ взвеси эритроцитов при вытитрованной дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при 37—38°С.