Титрация комплемента в бактериологической системе

Целью титрации является расчёт дозы комплемента, необходимой для реакции при испытании сывороток рогатого скота (для главного опыта) и изучения действия комплемента в присутствии заведомо негативных и заведомо позитивных перипневмонийных сывороток и

перипневмонийного антигена.

Комплемент титруется в различных разведениях с определённым между ними интервалом на двух перипневмонийных разной активности сыворотках и двух нормальных с обязательной постановкой контроля самих сывороток (т. е. без антигена).

Сыворотки поступают в реакцию в разведении 1:5 (на физиологическом растворе). Разведение комплемента из основного разведения 1 :10 начинается на два интервала ниже титра, полученного в гемолитической системе. Если титр комплемента в гемолитаческой системе 0,15, то начинают разливку его с 0,1; 0,12; 0,15; 0,18; 0,20; 0,22, 0,25. Каждое разведение комплемента ставят с контролем без антигена.

Схема титрации комплемента в бактериологической системе следующая:

Комплемент в разведении 1 :10 . . .	0,1	0,12	0,15	0,18	0,20	0,22	0,25
Недостающее количество физиологическо-го раствора	0,15	0,13	0,1	0,07	0,05	0,03	-
Антиген в его титре	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Сыворотка в разведении 1:5...,	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

Водяная баня при 37—38°С 20 минут.

Эритроциты барана (3%) ...... Гемолизин в рабочем титре ....

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

Водяная баня при 37—38°С 15 минут.

Титром комплемента для главного опыта считается минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в присутствии нормальной сыворотки, с перипневмонийным антигеном и без антигена, при соответствующей задержке гемолиза при наличии заведомо позитивной перипневмонической сыворотки в течение 15 минут в водяной бане при 37—38°С. Сама по себе перипневмонийная сыворотка в контрольной пробирке без антигена при данной дозе комплемента не должна давать задержку гемолиза.

Разведение комплемента для главного опыта

Требуется исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе в разведении 1 :10. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента содержится 0,02 (0,2:10—0,02), 0,02 XI 00 ===2,0 см³ чистого комплемента и 23,0 см³ физиологического раствора.

Титрация антигена

Перипневмонийный антиген применяют в титре, установленном учреждением, изготовившим его, но предварительно титр проверяет лаборатория, ставящая реакцию связывания комплемента.

Для установления титра антигена, последний испытывают на трёх отрицательных и трёх положительных по РСК сыворотках от животных, больных ПВЛ.

Положительные сыворотки должны быть различной активности при исследовании на РСК (++++, +++, ++ ).

Для постановки реакций необходимо пользоваться стандартными сыворотками, выпускаемыми учреждениями, изготовляющими перипиевмонийный антиген.

Испытание антигена производят по квадратной схеме, принципом которой является изучение специфической зоны действия антигена при различных разведениях сывороток.

Титрация антигена производится в 5 рядах пробирок, в каждом последующем ряду испытуется убывающая доза позитивной сыворотки.

Разведение сывороток: 1 :5; 1 :10; 1 ;20; 1 :40; 1 :60.

В каждом ряду соответствующих разведении сыворотки ставят с антигеном в различном разведении. Разведение антигена: 20 о/о; 40о/о; 6Оо/о; 80о/о; 100о/о.

Схема квадратного титрования антигена

1. Сыворотки предварительно разводят следующим образом:

Разведение 2,0 сыворотки + 8,0 физиологического раствора равно 1 :5

» 1,0 » + 9,0 » » 1:10

» 0,5 » +9,5 » » 1:20

» 0,25 » +9,75 » » 1:40

» 0,125 » +9,875 » » 1:80

1. Разведение антигена .........	100% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25	80% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25	60% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25	40% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25	20% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Антиген ...............
Одно разведение сыворотки ......
Комплемент в его титре 20 минут в во- дяной бане при 37—38°С ......
Гемолизин ..............
Эритроциты барана 3% взвесь .....

15 минут в водяной бане.

Одновременно» ставят контроль с нормальными сыворотками 1:5, а также испытывают антиген на самозадерживающие свойства (без сыворотки). По этой схеме ставят и остальные разведения сывороток. Рабочей дозой антигена следует считать количество антигена, дающее наиболее сильную задержку со всеми положительными сыворотками при полном гемолизе с нормальными сыворотками и с той же дозой антигена в отсутствии сыворотки.

Наиболее активным антигенам следует считать антиген с наиболее широкой дозой специфического действий при различных разведениях сыворотки.

Антиген, реагирующий в разведении менее 8.0^/о, для практического применения не допускается.