Лекция № 8. Многосубстратные микробные процессы

По своей природе микробный процесс обычно многосубстратен. Например, аэробный процесс дыхания идет с осуществлением следующего превращения углерода:

С₆Н₁₂О₆+6О₂ → 6Н₂О+6СО₂ (8.1)

Анаэробные микроорганизмы, как правило, также используют в качестве субстратов слабые восстановитель и окислитель. Например, обсуждаемая выше суммарная реакция с участием М thermoautotrophicum может быть записана в виде

4Н₂+СО₂ → СН₄+2Н₂О (8.2)

В данном случае водород и диоксид углерода выступают в качестве равноправных субстратов микроорганизма. Для фототрофных микроорганизмов типа микроводорослей и цианобактерий суммарное уравнение ассимиляции СО₂ имеет вид

СО₂+Н₂О→(СН₂О)+О₂ (8.3)

где (СН₂О)—условное обозначение образующихся веществ в клетке. В данном случае микробный процесс трехсубстратен, при этом в качестве одного из субстратов выступает свет.

Рост микроорганизма может представлять собой и псевдо-односубстратный процесс, если один из компонентов находится в большом избытке или поддерживается постоянным в процессе развития популяции. Например, большая группа анаэробных микроорганизмов для получения энергии использует конверсию углеводов по пути Эмбдена-Мейергофа, химическое уравнение которого в одном из вариантов выглядит следующим образом:

С₆Н₁₂О₆+Н₂О → 2СО₂+2Н₂+С₂Н₅ОН+СН₃СООН (8.4)

Здесь за счет большого избытка воды процесс имеет псевдо-односубстратный характер.

Реакции (8.1)-(8.4), протекающие с расходом основных субстратов и накоплением конечных продуктов ферментации, можно назвать базовыми химическими реакциями микробного процесса. Каждая группа микроорганизмов может быть охарактеризована своей собственной базовой химической реакцией.

Рассмотрим закономерности роста микроорганизмов в экспоненциальной фазе с учетом многосубстратности микробиологического роста.

8.1. Простейшие кинетические схемы

Из ферментативного катализа известны две принципиально различные простейшие кинетические схемы, проводящие к диск­риминируемым зависимостям скорости процесса от концентраций двух субстратов. С учетом автокаталитического процесса микробного роста эти две схемы могут быть представлены в таком виде:

S₁+N↔S₁N↔S₁S₂N→2N+Р (8.5)

S₁+N↔S₁N→Х+Р₁

S₁+X↔S₂X→2N+Р (8.6)

Механизм (8.5) включает две обратимые равновесные стадии присоединения субстратов (механизм тройного комплекса), в механизме (8.6) стадии присоединения субстратов разделены по крайней мере одной необратимой стадией. В терминах механизмов ферментативной кинетики группа механизмов типа (8.6) получила название пинг-понг-меха­низмов.

Две различные кинетические схемы приводят к двум различающимся зависимостям скорости роста от концентрации субстратов. Для механизмов группы (8.6) (пинг-понг-меха­низмы) характерна следующая зависимость от концентрации субстратов:

(8.7)

где К₁ и К₂—эффективные константы сродства микроорганизма к субстратам S₁ и S₂.

Для механизмов группы (8.5) (в одном из вариантов) уравнение удельной скорости роста может быть записано в виде

. (8.8)

Принципиальное различие уравнений (8.7) и (8.8) в той форме, в которой они записаны, заключается в том, что уравнение (8.8) содержит член, представляющий собой произведение S₁S₂ (механизм с мультиплицирующими субстратами). Это позволяет из зависимостей удельных скоростей роста от концентрации субстратов отличить механизм (8.5) от механизма (8.8). Для дискриминации механизмов необходимо исследовать зависимости удельной скорости роста от концентрации одного субстрата при постоянной концентрации другого субстрата, варьируя от серии к серии экспериментов концентрацию последнего.

• При анализе экспериментальных данных в соответствии с методами, развитыми для многосубстратных ферментативных реакций, удобно исполь­зовать один из двух подходов.

1. В обратных координатах для механизмов групп пинг-понг-зависимости (немультиплицирующие субстраты) скорости от концентрации субстрата будут представлены серией параллельных, непересекающихся, прямых (рис. 8.1). Для механизмов с тройным комплексом (мультиплицирующие субстраты), уравнения скорости которых включают произведение переменных S₁S₂ в обратных координатах, экспериментальные данные должны линеаризоваться, что приводит к серии пересекающихся прямых (рис. 8.2).

2. В некоторых случаях возможно провести эксперимент с определением ,,, где ,- максимальная удельная скорость роста и константа сродства, найденные по субстратуS₁ при каком-то фиксированном значении концентрации субстрата S₂; ,-максимальная удельная скорость роста и константа сродства, найденные по субстратуS₂ при фиксированном значении S₁. Механизмы (8.5) и (8.6) различаются по зависимости ,отS₂; ,отS₁. Так, для группы механизмов с немультиплицирующими субстратами (группа пинг-понг-механизмов) из уравнения (8.7) следует:

(8.9)

(8.10)

Рис. 8.1. Зависимости удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации субстратов (S₁ и S₂) в обратных координатах для группы пинг-понг-механизмов

Видно, что зависимости отS₂, отS₁, отS₂, отS₁ имеют гиперболический характер и должны линеаризоваться в обратных координатах, при этом значение /не должно зависеть от концентрации второго субстрата (рис. 8.3). Для механизмов с равновесным тройным комплексом [схема (8.5), (8.8)] вид зависимостейотS₂ и отS₁ совершенно другой следующий:

(8.9)

Рис. 8.2. Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от концент­рации субстратов (S₁ и S₂) в обратных координатах для механизмов с мультиплицирующими субстратами

Рис. 8.3. Зависимости параметров и, найденные при вариации субстратаS₁, от концентрации второго субстрата S₂ для групп пинг-понг механизмов.

=; . (8.10)

На рис. 8.4 и 8.5 приведены зависимости(S₂); (S₂); (S₁); (S₁); /. Сопоставление экспериментальных данных с теоретическими, представленными на рис. 8.1-8.5, позволяет определить, к какой кинетической группе относится тот или иной микробный процесс.

Рис. 8.4. Зависимость кинетических параметров и, найденных при вариации субстратаS₁, от концентрации второго субстрата S₂ для механизма с мультиплицирующими субстратами.

Рис. 8.5. Зависимость кинетических параметров и, найденных при вариации субстратаS₂, от концентрации первого субстрата S₁ для механизма с мультиплицирующими субстратами