Лекция № 9. Ингибирование и активация роста микроорганизмов

Ингибирование или активация роста популяции микроорганизмов - широко распространенное явление, в большом числе случаев определяющее скорость развития культуры.

Существует две основные классификации ингибиторов роста микроорганизмов: 1) по «мишени», на которую действует то или иное вещество; 2) по кинетическому механизму действия.

В рамках первой классификации можно выделить следующие типы воздействия.

1. Ингибиторы, действующие на ДНК. Характерный пример - налидиксовая кислота, ингибирующая синтез ДНК у Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hypomicrobium neptunium и других бактерий.

2. Ингибиторы, действующие на РНК. Ингибитор, например актиномицин D, разобщает процесс транскрипции - образова­ние РНК на матрице ДНК.

3. Ингибиторы синтеза белка, например хлорамфеникол, левомицетин, эритромицин, тетрациклин, подавляют процессы образования пептидных связей, что очень часто приводит к значительному накоплению микроорганизмами свободных аминокислот.

4. Ингибиторы синтеза полимеров бактериальной клеточной стенки—муреина и тейхоевых кислот. Наиболее изучено действие β-лактамных антибиотиков, в особенности пенициллина.

5. Мембраноактивные вещества. Действие этих ингибиторов связано с повреждением цитоплазматической мембраны и на­рушением ее проницаемости. К таким веществам относятся детергенты, органические растворители (толуол, хлороформ), спирты, фонолы, четвертичные аммониевые основания, полипептидные и полиеновые антибиотики.

6. Ингибиторы энергетических процессов. Специфическим ингибитором энергетических процессов является 2,4-динитрофенол - разобщитель окислительного фосфорилирования. Он проводит протоны через мембрану и изменяет градиент рН, при этом рост микроорганизмов ингибируется.

7. Ингибиторы лимитирующего фермента. Как известно, ферменты весьма «чувствительны» к различным соединениям, блокирующим функционально важные группы активного центра. В микробиологической кинетике это проявляется в уменьшении скорости роста популяции.

С точки зрения кинетики действия можно выделить следующие основные классы ингибиторов.

1. Вещества, необратимо взаимодействующие с компонента­ми растущей микробной клетки, составляют класс необратимых ингибиторов. Кинетика их действия в дифференциальной форме может в большинстве случаев быть описана уравнением

, (9.1)

соответствующим схеме

N+INI, (9.2)

где N число клеток; I - концентрация необратимо действую­щего ингибитора; NI - число ингибированных клеток; k - константа скорости второго порядка. Как правило, необратимое ингибирование - относительно медленный процесс, развивающийся во времени.

2. Вещества, быстро и обратимо взаимодействующие с молекулами-«мишенями», объединяют в класс обратимых ингибиторов. Процесс обратимого ингибирования можно описать схемой

N+INI, (9.3)

где К—эффективная константа равновесия. Действие обратимых ингибиторов проходит, как правило, относительно быстро, практически мгновенно с точки зрения времени развития микробной популяции.

3. Для микробиологических процессов весьма характерен эффект ингибирования продуктом ферментации, в результате чего его накопление в достаточных количествах может приводить к замедлению скорости роста популяции. Ингибирование продуктом ферментации может иметь как обратимый, так и необратимый характер.

4. Важный регуляторный микробиологический феномен связан с ингибированием избытком субстрата. В этом случае субстрат, который при относительно низких концентрациях увеличивает скорость роста популяции, при более высоких концентрациях может быть эффективным ингибитором роста микроорганизмов.

Активаторами называют соединения, которые, не будучи необходимы для роста, могут заметно увеличивать максимальную скорость роста культур микроорганизмов.

Рассмотрим основные закономерности обратимого ингибирования и активации роста популяции микроорганизмов в экспоненциальной фазе.

По аналогии с кинетикой ферментативных реакций влияние эффектора К в процессе роста биомассы с лимитирующим субстратом может быть передано схемой

NNS2N+P

K_R αK_S (9.4)

RNRNSRN+P

где К_S, К_R - константы диссоциации комплекса субстрата S и эффектора R с молекулой-«мишенью» клетки N; µ_m - максимальная удельная скорость роста.

Можно показать, что математическая обработка схемы (9.4) приводит к следующему выражению для удельной скорости роста:

(9.5)

Рассмотрим некоторые важные частные случаи, имеющие особое значение для описания кинетики роста культур микроорганизмов.

1. Полное конкурентное ингибирование (α→∞, β=0). В этом случае удельная скорость роста в экспоненциальной фазе определяется выражением

, (9.6)

Зависимость в обратных координатах имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат (рис. 9.1, а). Константу конкурентного ингибирования К_R можно определить с помощью выражения

, (9.7)

если представить экспериментальные данные в координатах K_эф от R.

Рис. 9.1. Зависимость µ от S в обычных и двойных обратных координатах при конкурентном (а) и неконкурентном (б) ингибировании роста микро­организмов

Для определения К_R можно также применять метод Диксона, согласно которому экспериментальные данные откладывают в координатах (1/µ, [R]) (рис. 9.2).

2. Полное неконкурентное ингибирование(α→1, β=0). В этом случае удельная скорость роста культуры определяется выражением

. (9.8)

Рис. 9.2. Зависимость µ (а) и 1/µ(б) от концентрации ацетата при росте Е. coli в анаэробных (кривые 1) и аэробных (кривые 2) условиях

Зависимость в координатах Лайнуивера-Бёрка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс (рис. 9.1, б). Константу неконкурентного ингибирования можно определить с помощью выражения

, (9.9)

путем построения графика в координатах (1/μ_m, [R]) или с помощью метода Диксона. В качестве иллюстрации рассмотрим данные по ингибированию ацетатом роста Е. coli в аэробных и анаэробных условиях. Установлено, что ацетат является неконкурентным ингибитором роста. Зависимость μ от концентрации ацетата приведена на рис. 9.2, а. На рис. 9.2, б эти же данные представлены в координатах Диксона, которые позволяют определить константы неконкурентного ингибирования: для анаэробного процесса К_R=11 мМ, для аэробного – К_R = 23,5 мМ.

3, Неконкурентная активация (α=1, β>1). Как следует из уравнения (9.5), в этом случае максимальная скорость роста увеличивается:

. (9.10)

Зависимость скорости роста в координатах Лайнуивера-Бёрка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс. Анализ уравнения (9.10) можно проводить с помощью выражения

, (9.11)

преобразованного к виду

. (9.12)

Из этого выражения видно, что построение графика в координатах позволяет провести раздельное определение констант β иK_R. По механизму неконкурентной активации описывается реакция клеток Hela человека на инсулин. При недостатке инсулина скорость их роста очень низка. Введение инсулина заметно увеличивает скорость роста клеток. Имеются и другие факты, говорящие об активирующем действии разнообразных веществ на рост микробных клеток и клеток культуры тканей.

4. Смешанные типы ингибирования и активации (α≠1, β≠1). Графики в двойных обратных координатах имеют вид пучка прямых, соответствующих различным концентрациям эффектора и пересекающихся в общей точке с координатами

(9.13)

(9.14)

Из выражений (9.13), (9.14) видно, что положение точки пересечения определяется лишь значениями α и β и не зависит от K_R. Таким образом, вид графика в обратных координатах может быть использован для определения типа влияния эффектора на процесс роста популяции микроорганизмов.