Лекция № 3. Рост микроорганизмов на с1 субстратах

С₁ субстраты представляют собой органические соединения содержащие один атом углерода. К ним относятся метан, метанол, формальдегид, муравьиная кислота (формиат). Такие субстраты могут усваивать некоторые виды бактерий, отличительной особенностью которых является то, что эти бактерии не могут использовать цикл трикарбоновых кислот для образования окислительных эквивалентов.

Микроорганизмы способные усваивать С₁ субстраты можно подразделить на две подгруппы:

1. Облигатные метилотрофы, которые растут только за счет соединений, содержащих не углерод-углеродные связи.

2. Факультативные метилотрофы, которые растут на различных углеродных субстратах, включая С₁ соединения. Большинство из этих микроорганизмов используют метанол и метиламин, но не метан.

Облигатные метилотрофы.

К облигатным метилотрофам относятся бактерии родов Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas,, Methylobacter и Methylococcus.

При использовании для роста метана восстановительные эквиваленты для дыхательной цепи могут быть получены только путем окисления метана до СО₂, поскольку в этих условиях не образуется ацетил-СоА, необходимый для окисления в цикле трикарбоновых кислот. Окисление метана происходит по следующей схеме:

CH₄ + O₂ + NADH₂ → CH₃OH + H₂O + NAD

CH₃OH + X → CH₂O + XH₂

CH₂O + X + H₂O → HCOOH + XH₂

HCOOH + NAD → CO₂ + NADH₂.

В начале метан окисляется монооксигеназой до метанола. Окисление метанола до формальдегида и формальдегида до формиата сопряжено с восстановлением переносчика Х до ХН₂. Переносчиком по видимому служит цитохром типа с. На последнем этапе, в результате формиатдегидрогеназной реакции образуется NADH_2, необходимый для первой стадии окисления метана.

Хотя при окислении метана не образуется ацетил-СоА, это вещество необходимо для процессов биосинтеза. Образование ацетил-СоА у метилотрофов может проходить по двум путям – серин-изоцитрат-лиазному и рибулозомонофосфатному.

Серин-изоцитрат-лиазный путь. Образование ацетил-СоА происходит из формальдегида и СО₂ по следующей схеме:

формальдегид + глицин → серин

серин → гидроксипируват + NH₂⁺

гидроксипируват + NADH₂ → глицерат + NAD

глицерат + АТР → глицерат-3-фосфат + АDР

глицерат-3-фосфат → фосфоенолпируват + Н₂О

фосфоенолпируват + СО₂ → оксалоацетат + Р_i

оксалоацетат + NADH₂ → малат + NAD

малат + АТР + СоА → малил-СоА + АМР + РР_i

малил-СоА → глиоксилат + ацетил-СоА

глиоксилат + NH₂⁺ → глицин.

Акцептором формальдегида служит глицин, а серин, образовавшийся под действием гидроксиметилазы, превращается в соответствующую α-оксокислоту в результате трансаминазной реакции. Далее гидроксипируват превращается в фосфоенолпируват под действием нескольких ферментов. В результате реакции, катализируемой фосфоенолпируват-карбоксилазой, возникает оксалоацетат. Ключевой фермент образования глиоксилата – малил-СоА-лиаза.

Цикла образования ацетил-СоА из формальдегида и углекислого газа недостаточно, чтобы обеспечить клетки фосфоенолпируватом и оксалоацетатом для биосинтетических нужд. Обеспечение нужным количеством этих соединений достигается прямым образованием сукцината из двух молекул СО₂ и двух молекул формальдегида. Серин-изоцитрат-лиазный путь имеется у Methylosinus и Methylocystis, а также у ряда факультативных метилотрофов.

Рибулозомонофосфатный цикл. Ключевыми реакциями этого цикла являются конденсация рибулозо-5-фосфата и формальдегида под действием гексулозо-6-фосфат-синтазы и изомеризация продукта во фруктозо-6-фосфат (рис. 3.1).

рибулозо-5-фосфат + формальдегид → D-эритро-L-глицерол-3-гексулозо-6-фосфат

D-эритро-L-глицерол-3-гексулозо-6-фосфат → фруктозо-6-фосфат

Акцептор (рибулозо-5-фосфат) регенерируется под действием транскетолазы и трансальдолазы. 3 молекулы рибулозо-5-фосфата образуются из 2-х молекул фруктозо-6-фосфата и молекулы глицеральдегид-3-фосфата. А 3 молекулы формальдегида оказываются в конечном счете в одной молекуле дигидроксиацетонфосфата, который может использоваться для целей биосинтеза.

Рис. 3.1.Рибулозомонофосфатный цикл.

Рибулозомонофосфатный цикл осуществляется у представителей Methylomonas и Methylococcus.

Факультативные метилотрофы.

Помимо облигатных метилотрофов существует ряд других микроорганизмов, способных использовать для роста С₁ субстраты и более сложные органические вещества. К ним относятся некоторые дрожжи, псевдомонады. Эти микроорганизмы используют метанол, формиат или метиламин, но не способны расти на метане. Хотя есть бактерии (Methylobacterium organophilum) которые являются факультативными метилотрофами, но способные использовать в качестве источника углерода и метан.

Неполное окисление.

При росте аэробных гетеротрофов часть субстрата в норме окисляется до СО₂, а остальная часть используется для синтеза клеточного материала. У некоторых организмов полное окисление органического субстрата невозможно, в результате у них образуются и выделяются частично окисленные продукты – обычно органические кислоты. Например, группа уксуснокислых бактерий не способна окислять ацетат. Эти бактерии растут на средах с этанолом, и их метаболизм можно описать следующим образом.

Этанол окисляется алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназами с образованием ацетата и 2 молекул NADH₂.

Образующийся таким образом NADH₂ используется для получения АТР в дыхательной цепи; ацетил-СоА не может быть окислен в цикле трикарбоновых кислот, и, следовательно, большая часть образовавшегося ацетата выделяется.

Кроме этанола, уксуснокислые бактерии окисляют большое количество других спиртов до соответствующих кислот и кетонов.

Пропанол → пропионат

Изопропанол → ацетон

Глицерол → дигидроксиацетон

Глюкоза → глюконат

Глюконат → 5-кетоглюконат.

Эти организмы также не способны к синтезу катаболических ферментов, необходимых для высокоактивного расщепления этих субстратов. В результате они выделяют в среду кислоты и кетоны. Особый интерес представляет окисление уксусными бактериями D-сорбитола до L-сорбозы. Последняя требуется в больших количествах для синтеза витамина С.

Многие микроорганизмы переходят от полного окисления к неполному при аномальных условиях (высокие концентрации субстрата или крайние значения рН). Дрожжи и другие грибы выделяют в определенных условиях цитрат, фумарат и глюконат. Их используют для получения этих кислот в промышленном масштабе. Некоторые коринебактерии способны выделять большие количества L-глутамата. Эти микроорганизмы, а также ряд других, используются в настоящее время для получения аминокислот и других метаболитов.

Большинство бацилл осуществляет неполное окисление при росте на углеводах. Например, при аэробном росте B.megaterium глюкоза частично превращается в ацетат, пируват, ацетоин и 2,3-бутандиол. Когда глюкоза истощается, эти соединения снова поглощаются. Они окисляются до СО₂ и таким образом служат источником АТР.

Рост на ароматических соединениях

Растения образуют большое количество соединений содержащих ароматические кольца. Ароматические аминокислоты и витамины встречаются во всех организмах. Все эти соединения высвобождаются, когда организмы умирают и органическая материя распадается. Они разрушаются бактериями и грибами. Млекопитающие способны разрушать только фенилаланин и тирозин, но не триптофан и другие ароматические соединения.

Разрушение фенилаланина и тирозина в клетках животных и микроорганизмов происходит по следующими пути:

Фенилаланин под действием фермента фенилаланин-гидроксилаза превращается в тирозин. Далее тирозин → п-гидросифенилпируват → гомогентизиновая кислота → 4-малеилацетоацетат → 4-фумарилацетоацетат → фумарат + ацетоацетат (рис. 3.2).

Ключевым промежуточным продуктом здесь является гомогентизиновая кислота, которая окисляется в малеилацетат и метаболизируется дальше в фумарат и ацетоацетат. Ряд бактерий способны сходным образом расщеплять гентизиновую кислоту,

Рис.3.2. Распад фенилаланина и тирозина на пути гомогентизиновой кислоты

1 – фенилаланин-гидроксилаза; 2 – реакция переаминирования; 3 – п-гидроксифенилпируват-оксидаза, катализирующая декарбоксилирование, миграцию боковой цепи и гидроксилирование кольца;4 - гомогентизат-оксидаза; 5 – малеилацетоацетат-изомераза; 6 – фумарилацетоацетат-гидролаза.

образуя в результате фумарат и пируват. Гентизиновая кислота

может быть образована например, путем гидроксилирования

м-гидроксибензойной кислоты.

Гомогентизиновая и гентизиновая кислота не единственные соединения способные подвергаться окислительному расщеплению до неароматических продуктов. Большинство ароматических соединений превращается под действием микроорганизмов в катехол и протокатеховую кислоту, которые служат исходным субстратом для последующих реакций окислительного расщепления (рис. 3.3 и.3.4).

Рис.3.3. Ароматические и гидроароматические соединения, которые могут быть превращены в протокатеховую кислоту.

Для катехола и протокатеховой кислоты известно два типа реакций расщепления: орто-расщепление и мета-расщепление.

Орто-расщепление или 3-оксоадипатный путь.

Ароматические кольца катехола и протокатехата разрываются в результате оксигеназных реакций между двумя гидроксильными группами. Образующиеся при этом продукты дают затем первое общее промежуточное соединение этих путей – 4-оксоадипатеноллактон. Это соединение распадается далее с образованием сукцината и ацетил-СоА (рис. 3.5).

Рис. 3.4. Ароматические соединения, которые могут быть превращены в катехол.

Рис. 3.5. Реакции 3-оксоадипатного пути

Рис. 3.6. Мета-расщепление катехола и протокатеховой кислоты

Мета-расщепление.

Некоторые микроорганизмы, например, почвенная псевдомонада, осуществляет расщепление катехола и протокатеховой кислоты по пути отличному от вышеприведенного. В этом случае кольцо раскрывается по соседству с гидроксильной группой, так что образуется соединения полуальдегидной природы. Дальнейший метаболизм этих продуктов приводит к образованию пирувата, формиата и ацетальдегида (рис.3.6).

Потребности бактерий в факторах роста

До сих пор предполагалось, что микроорганизмы способны сами синтезировать все необходимые для роста органические соединения. На самом же деле существуют С-автотрофные бактерии, получающие углерод для синтеза клеточных компонентов клеток исключительно из СО₂ (например, Alcaligens eutropus и Nitrobacter winogradskyi), и С-гетеротрофы, растущие на средах с такими простыми источниками углерода, как глюкоза (например, Escherichia coli, Bacillus megaterium и Clostridium pasteurianum). Однако многие бактерии лишены способности синтезировать все органические соединения, необходимые для роста, и зависят от наличия в среде определенных факторов роста. Эти факторы можно объединить в три группы:

1) витамины и родственные соединения, требующиеся в малых количествах;

2) аминокислоты;

3) пурины и пиримидины.

Количество и природа факторов роста, которые должны присутствовать в инкубационной среде, различны для разных бактерий. Для роста молочнокислых бактерий требуются практически все аминокислоты, пурины, пиримидины и витамины. Способность к процессам биосинтеза у этих организмов довольно ограничена. Общим свойством всех микроорганизмов является потребность в витаминах и родственных соединениях. Некоторые из этих соединений, а также их функции в обмене веществ приведены в таблице 3.1.

	Таблица 3.1.
Витамины, близкие к ним соединения и соответствующие функции в метаболизме
Соединение	Функция метаболизма
п-Аминобензойная кислота	Предшественник тетрагидрофолиевой кислоты; кофермент, участвующий в переносе одноуглеродных единиц
Биотин	Простетическая группа ферментов, катализирующих реакции карбоксилирования
Продолжение таблицы 3.1
Кофермент М	Кофермент, участвующий в образовании метана
Фолиевая кислота	Тетрагидрофолиевая кислота является коферментом, участвующим в переносе одноуглеродных единиц
Гемин	Предшественник цитохромов
Липоевая кислота (дитио-октановая кислота)	Простетическая группа пируватдегидрогеназного комплекса
Никотиновая кислота	Предшественник NАDиNADP, являющихся коферментами многих дегидрогеназ
Пантотеновая кислота	Предшественник кофермента А и простетическая группа ацилпереносящих белков
Пиридоксин (витамин В6)	Пиридоксальфосфат служит коферментом трансаминаз и декарбоксилаз аминокислот
Рибофлавин (витамин B2)	Предшественник флавинмононуклеотида (FМN) и флавинадениндинуклеотида (FАD), являющихся простетическими группами флавопротеидов
Тиамин (витамин В1)	Тиаминпирофосфат служит простетической груп­пой декарбоксилаз, трансальдолаз и транскетолаз
Витамин В12(цианкобал- амин)	Кофермент В12 участвует в реакциях перегруппировок (например, глутаматмутаза)
Витамин К	Предшественник менахинона, функционирующего как переносчик электронов (например, в фумаратредуктазе)

Потребность в факторах роста точно установлена не для всех микроорганизмов. Поэтому в среду часто добавляют дрожжевой экстракт и пептон в качестве полноценных и дешевых источников таких факторов. При использовании в специальных целях синтетических сред (т. е. сред известного состава) удалось установить потребность в факторах роста у ряда микроорганизмов. Так, Clostridium kluivery растет на среде, содержащей биотин и п-аминобензойную кислоту. В среды для многих фототрофных бактерий добавляют раствор витаминов, содержащий никотиновую кислоту, тиамин, п-аминобензойную кислоту, биотин и витамин В₁₂. Некоторые микроорганизмы характеризуются особыми потребностями. Так, у видов Haemophilus среда должна содержать гемин для биосинтеза цитохромов, а также NАD. Гемин требуется представителям рода Bacteriodes. Methanobacterium ruminantium растет только в присутствии кофермента М (2-меркап-тоэтансульфоновой кислоты) и 2-метил-н-масляной кислоты. Эти несколько примеров свидетельствуют о том, что у микроорганизмов могут быть нарушены процессы биосинтеза различных соединений и что многие из них нуждаются в определенных факторах роста.