Лекция № 7. Экспоненциальная фаза роста культур микроорганизмов

В условиях постоянства концентраций субстратов и других компонентов, необходимых для роста микроорганизмов, процесс увеличения числа клеток имеет автокаталитический характер.. Автокаталитическая природа процесса означает, что скорость накопления микробной биомассы (скорость накопления клеток) прямо пропорциональна числу клеток в системе. Количество биомассы может выражаться в различных единицах (в г/л, в числе клеток в единице объема и др.). Рассмотрим закономерности развития микробных популяций в экспоненциальной фазе роста.

7.1 Определение параметров роста культуры

Уравнение скорости роста при постоянстве концентрации субстрата представляет собой дифференциальное уравнение первого порядка с разделяющимися переменными и может быть легко проинтегрировано:

M=N₀e^µ, (7.1)

где N₀ — количество биомассы, число клеток в начальный момент времени. В полулогарифмических координатах это уравнение имеет вид

lnM=lnN₀+μ. (7.2)

В качестве экспериментального примера можно рассмотреть данные, приведенные на рис. 7.1, а, на котором представлена динамика изменения числа клеток в процессе роста метанобразующей бактерии Methanolobus tindaris. Видно, что число клеток экспоненциально увеличивается во времени. Данные рис. 7.1а достаточно хорошо линеаризуются в координатах уравнения (7.2) в течение первых 20 ч процесса. Значение μ, найденное из линейного участка кривой рис. 7.1б, равно 0,28 ч^-1.

Можно предложить и другую процедуру определения μ. Это так называемый разностный метод анализа. Исходя из уравнения (7.2) в данный, конкретный, момент времени _i справедливо равенство

lnM_i=lnN₀+μ_i. (7.3)

Рис.7.1. Кривая роста культуры М.tindaris на среде с метанолом при 37° C, рН 7,0 (a); те же данные в полулогарифмических координатах (б)

Во время соответствующее периоду _j,

lnM_j=lnN₀+μ_j (7.4)

Если вычесть уравнение (7.4) из (7.3), то получаем

(7.5)

Таким образом, если изобразить графически уравнение (7.5) в коэффициентах ln(М_i/М_j); (_i - _j) при условии, что кинетика процесса описывается экспоненциальной функцией (7.1), то можно получить прямую, тангенс угла наклона которой дает значение удельной скорости роста μ.

Важным экспериментальным фактом, обнаруженным и исследованным на большом числе примеров, является зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата, количество которого лимитирует скорость роста культур микроорганизма (7.3).

Уравнение (7.3) отражает участие лимитирующего фермента в росте микробной популяции. Поэтому при анализе развития микробных культур в условиях экспоненциальной фазы роста применим достаточно хорошо разработанный набор методов для описания стационарной кинетики ферментативных реакций.

Методы анализа зависимости удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата рассмотрим на примере роста метанообразующей бактерии Methanobacterium thermoautotrophicum. Известно, что эта бактерия развивается на минеральной среде в атмосфере молекулярного водорода и диоксида углерода, причем последний является единственным источником углерода. Зависимость удельной скорости роста µ от концентрации каждого из газов при фиксированной

Рис. 7.2. Зависимость удельной скорости роста М. thermoautotrophicum от концентрации Н2 во входящем газе (а); (рН 7,0, 65^oС, 20% CO2), те же данные в двойных обратных координатах (б)

Рис. 7.3. Зависимость удельной скорости роста М. thermoautotrophicum от концентрации СО2 во входящем газе (рН 7,0, 65^oС, 80% Н2), те же данные в двойных обратных координатах (б)

концентрации другого газа приведена на рис. 7.2 и 7.3. Как видно из рисунка, μ по гиперболическому закону зависит от концентрации Н₂ и от концентрации СО₂ во входящем газе. По аналогии с уравнением Михаэлиса-Ментен для кинетики ферментативных реакций µ и К_S могут быть определены на основе линеаризации уравнения (7.3):

(7.6)

Из данных рис. 7.2,б и 7.3,б были найдены следующие значения параметров: =0,49 ч^-1; =20% (значения максимальной удельной скорости роста и константы сродства, найденные при вариации концентрации водорода и при постоянной концентрации СО₂, равной 20%); =0,61 ч^-1;

=11% (значения максимальной удельной скорости роста и константы сродства, найденные при вариации СО₂ и постоянной концентрации водорода, равной 80%).

Кроме анаморфозы (7.6) линеаризацию можно проводить также и другими способами, например, используя уравнения:

; (7.7)

; (7.8)

. (7.9)

На рис. 7.4 приведены прямые, соответствующие линеаризации данных рис. 7.2, а в координатах уравнений (7.7) и (7.8).

Согласно анализу, проведенному Э. Корниш-Боуден (1979), наименее удовлетворительные результаты дает наиболее распространенная модификация уравнения (7.3)-метод двойных обратных координат (7.6). Графическое представление результатов с использованием этого метода не дает почти никакой визуальной информации о статистической ошибке. Эта ошибка лучше всего визуализируется при использовании координат S/µ от S [уравнение (7.8)].

В принципе для определения параметров µ_m и K_S достаточно двух измерений удельной скорости роста µ_i и µ_j при двух различающихся концентрациях субстрата S_i и S_j:

Рис. 7.4. Данные рис. 7.2, а в координатах уравнений (7.8) и (7.9)

; (7.10)

(7.11)

В силу существующих реальных статистических ошибок в определении скоростей и концентраций компонентов обычно проводят 5-10 измерений скорости при концентрациях субстрата, соизмеримых с К_S. Для каждой пары измерений можно вычислить значения μ_m и К_S и затем провести статистическую обработку результатов, определив среднее значение и среднеквадратичное отклонение параметра от среднего значения.

Для графического определения μ_m и К_S и визуального нахождения ошибки удобно воспользоваться методом Корниш-Боуден. Из уравнения (7.3) следует уравнение связи между параметрами μ_m и К_S:

. (7.12)

В координатах μ_m от К_S эта зависимость должна быть представлена прямой с тангенсом угла наклона µ/S и отрезком μ. Таким образом, для любой пары экспериментально измеряемых переменных µ и S значения μ_m и К_S лежат на этой

Рис. 7.5. Данные рис. 7.2, а в координатах Корниш-Боуден

прямой, а точка пересечения прямых в координатах µ от -S, если таковая существует, дает значения μ_mи К_S.

Преимущество этого метода связано с тем, что при определении параметров нет необходимости в предварительной обработке и пересчете экспериментальных данных. Важным представляется хорошая визуализация статистической ошибки в определении μ_m и К_S.

На рисунке 7.5 приведены данные скорости роста М. thermoautotrophicum в координатах µ (-S). Прямые пересекаются в одной точке, координаты точек пересечения дают значения μ_m и К_S. В настоящее время графические модификации уравнения Михаэлиса-Ментен, как и уравнения Моно, применяют для визуальной иллюстрации соответствия экспериментальных данных гиперболической зависимости (7.3). Для численного определения μ_m и К_S чаще используют методы статистической обработки результатов и ЭВМ, дающие помимо числовых значений параметров достоверные сведения о статистических ошибках.