Лекция № 5. Кинетика ферментативных реакций

В начале прошлого века на основании экспериментальных данных полученных при изучении скорости ферментативных реакций в зависимости от концентрации субстрата было получено эмпирическое уравнение, которое в настоящее время известно как уравнение Михаэлиса-Ментен

. (5.1)

Это же уравнение можно получить исходя из законов формальной кинетики химических реакций и модели взаимодействия фермента с субстратом.

Ферментативную реакцию можно представить следующим образом. При взаимодействии фермента Е с субстратом S образуется фермент-субстратный комплекс ES (5.2). Для такого взаимодействия делается допущение, что реакция образования фермент-субстратного комплекса является обратимой. Далее, в результате каталитических процессов, происходит образование продукта ферментативной реакции Р и высвобождение фермента Е (5.3).

S+E↔ES (5.2)

ES→P+E (5.3)

Полученную модель ферментативной реакции можно описать, как говорилось выше, используя законы формальной кинетики химических реакций. Так как образование фермент-субстратного комплекса процесс обратимый, то для 5.2 будет справедливо уравнение

, (5.4)

где s – концентрация субстрата;

е – концентрация фермента;

(еs) – концентрация фермент-субстратного комплекса;

k_-1 – константа скорости обратной реакции;

k₁ – константа скорости прямой реакции;

K_m – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Величина K_m получила название константа Михаэлиса, или константа сродства к субстрату.

Скорость протекания реакции образования продукта (5.3)

, (5.5)

где v – скорость образования продукта Р;

k₂ – константа скорости реакции.

Общая концентрация фермента будет состоять из суммы концентраций свободного фермента и фермента входящего в фермент-субстратный комплекс

e₀=e+(es), (5.6)

где е₀ – общая концентрация фермента.

Из выражения 5.5 следует, что

. (5.7)

Из выражения 5.4, с подстановкой в него значения (es) из 5.7, следует, что

. (5.8)

Подставим выражения 5.7 и 5.8 в уравнение 5.6. В результате подстановки получаем

. (5.9)

Выражение 5.9 можно преобразовать к виду

. (5.10)

Произведение k₂∙e₀ по существу является максимально возможной скоростью ферментативной реакции v_max. Таким образом мы получаем уравнение скорости ферментативной реакции в виде

(5.11)

идентичное уравнению Михаэлиса-Ментен.

Скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата до определенных значений последнего (рис.5.1). В дальнейшем, как бы не увеличивалась концентрация субстрата, скорость ферментативной реакции остается постоянной. Эта величина получила название максимальная скорость ферментативной реакции v_max. Константа Михаэлиса K_m числено равна концентрации субстрата при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной.

Из графической зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата невозможно достаточно точно определить значения максимальной скорости реакции v_max и константы Михаэлиса K_m.

Так же невозможно определить эти величины из уравнения Михаэлиса-Ментен.

Для нахождения максимальной скорости реакции v_max и константы Михаэлиса K_m уравнение 5.1 приводят к линейному виду. Причем сделать это можно разными способами.

Если взять обратные величины левой и правой части уравнения 5.1, то оно преобразуется к следующему виду

(5.12)

Представив правую часть уравнения 5.12 в виде суммы получаем

. (5.13)

В полученном уравнении величина линейно зависит от величины. Если экспериментальные данные по исследованию скорости ферментативных реакций от концентрации субстрата представить в этих координатах получится линейная зависимость (рис.5.2). Продолжив которую до пересечения с осями абсцисс и ординат получают обратные значения максимальной скоростиv_max (точка пересечения с осью ординат) и константы Михаэлиса K_m (точка пересечения с осью абсцисс).

Такой графический способ определения значений v_max и K_m получил название метод обратных координат Лайнуивера-Берка. Кроме этого, как говорилось выше, параметры уравнения Михаэлиса-Ментен можно определить, использовав координаты Эди и Хофсти.

Для нахождения параметров уравнения Михаэлиса-Ментен в координатах Эди, его нужно привести к виду

. (5.14)

Тогда точки пересечения линейной зависимости с осями ординат и абсцисс дадут соответственно значения и –K_m, а тангенс угла наклона дает значение обратной величины максимальной скорости ферментативной реакции (рис. 5.3).

Для нахождения параметров с использованием координат Хофсти, уравнение Михаэлиса-Ментен приводится к виду

(5.15)

В этом случае точка пересечения с осью абсцисс даст величину v_max/K_m, а точка пересечения с осью ординат – значение v_max. Тангенс угла наклона будет равен значению -K_m (рис.5.4 )