Лекция № 10. Влияние рН на кинетику роста микроорганизмов

Одним из важнейших факторов, определяющих скорость роста популяции микроорганизмов, является концентрация ионов водорода. Многие микроорганизмы растут в достаточно узком диапазоне рН, при этом как увеличение концентрации ионов водорода (понижение рН), так и ее уменьшение (повышение рН) приводят к существенному замедлению скорости микробного процесса и даже к его прекращению. Влияние концентрации ионов водорода на скорость роста микроорганизмов—достаточно сложное явление. Ее изменение может затрагивать многие стороны функционирования микробной клетки.

Прежде всего концентрация ионов водорода может регулировать ионное состояние субстрата в том случае, если субстрат содержит ионогенную группу. Например, весьма распространенная группа субстратов - аминокислоты - содержит две ионогенные группы, присоединение ионов водорода к которым существенным образом изменяет заряд молекулы и соответственно проницаемость клеточной мембраны для этого субстрата. Один из важных субстратов для многих микроорганизмов - диоксид углерода в водных растворах - существует в трех формах. Если клетка акцептирует этот субстрат лишь в одном ионном состоянии, то изменение концентрации ионов водорода до значений, выходящих за пределы соответствующего значения рК_а, должно изменить концентрацию необходимого субстрата и тем самым скорость роста культуры. Поэтому в первую очередь при интерпретации рН-зависимости роста микроорганизмов необходимо обратить внимание на возможность отражения в кинетике роста ионных состояний субстрата.

Другая важная особенность рН-зависимостей роста микроорганизмов заключается в том, что концентрация ионов водорода внутри клетки может существенным образом отличаться от рН в растворе. В силу буферных свойств молекулярных компонентов клетки либо в силу действия специализированного механизма стабилизации рН в клеточной среде рН может быть смещен на некоторое значение по сравнению с рН культуральной среды. Δ рН определяется многими факторами, однако можно думать, что эта величина постоянна. Другими словами, это означает, что концентрация ионов водорода в каком-либо компартменте клетки линейно связана с концентрацией Н⁺ во внешней среде.

Рассмотрим следующую простейшую модель. Представим себе мембрану, полупроницаемую для ионов водорода, через которую осуществляется перенос ионов водорода в прямом и обратном направлениях. В этом случае кинетика переноса может быть описана следующим дифференциальным уравнением в предположении, что скорости переноса пропорциональны Н⁺ во внешней (Н_внеш) и во внутренней (Н_внутр) среде:

, (10.1)

где α, β — кинетические коэффициенты.

Если равновесие переноса устанавливается относительно быстро, , то соответственно имеем

. (10.2)

Концентрации ионов водорода во внешней среде и внутри компартмента связаны линейным соотношением, при этом если α/β>1, то в клетке поддерживается более «кислая» среда; если α = β, то значение рН внутри и во вне клетки одинаково, если α/β<1, то в клетке устанавливается более щелочная среда.

Наиболее существенным фактором, определяющим кинетическое поведение популяции микроорганизмов при различных рН, является зависимость от рН кинетики действия ферментов, прежде всего лимитирующего рост фермента. Представим себе случай, при котором состояние активного центра лимитирующего фермента определяется двумя ионогенными группами с константами ионизации К_а и К_b:

К_а К_b

(10.3)

Если каталитически активна лишь форма ЕН⁺, то кинетическую схему можно представить в виде

(10.4)

где NH₂⁺, NH⁺, N – состояния клетки, содержащие лимитирующий фермент в формах ЕН^{2 +}, ЕН ⁺, Е соответственно. Кинетической схеме (10.4) соответствует уравнение роста

(10.5)

где Н⁺ — внутренняя концентрация ионов водорода в компартменте, в котором функционирует фермент.

Уравнение (10.5) соответствует «классическому» уравнению роста микроорганизмов, в котором максимальная удельная скорость и константа сродства зависят от концентрации ионов водорода:

(10.6)

(10.7)

В соответствии с выражением (10.5) график зависимости от рН представляет собой симметричный колокол.

Из уравнений (10.5) — (10.7) следует, что анализ зависимости μ_m^каж от рН позволяет найти значения констант диссоциации групп комплекса лимитирующего фермента с субстратом (К'_а и К'_b), а анализ рН-зависимости отношения приводитк значениям констант диссоциации лимитирующего фермента в отсутствие связывания с субстратом (К_а и К_b).

Экспериментально исследуется зависимость μ от Н⁺ _внеш, т. е. от концентрации ионов водорода в культуральной среде. В соответствии с этим уравнения (10.6) и (10.7) модифицируются к виду

(10.8)

(10.9)

Из уравнений (10.8) и (10.9) видно, что различие внешней и внутренней концентрации ионов водорода приводит к различию в экспериментально определяемых значениях констант ионизации:

(10.10)

(10.11)

На практике широко распространен случай, когда субстрат, связываясь с ферментом, не изменяет значений констант диссоциации ионогенных групп лимитирующего фермента [К_а = К'_a, К_b = К'_b по схеме (10.4)]. В этом случае константа связывания К_S не зависит от рН:

(10.12)

причем

(10.13)

При исследованиях рН-зависимостей экспериментатору желательно работать в условиях К_S<<S, в этом случае μ = μ_m^каж и для определения констант диссоциации удобно применять логарифмические координаты (lg μ_m^каж, рН). Логарифмируя выражение (10.13), получаем

(10.14)

В кислой области, где , после пренебрежения малыми членами получаем

(10.15) или

(10.16)

В щелочной области, где, получаем

(10.17)

В области нейтральных рН, если исильно различаются, то

. (10.18)

Если же К_а и К_b различаются меньше чем на порядок, то для описания зависимости μ от рН необходимо применять выражение (10.13) в неизменном виде.