Биотехнология в животноводстве

Так, если после индуцирования полиовуляции от одной коровы – до- нора получают до 10 тубальных, т.е. созревших in vivo, и овулировавших ооцитов, то из яичника коровы можно извлечь до 200 фолликулярных ооцитов. Созревание ооцитов при культивировании достигает 80% и вы- ше, а их оплодотворяемость – до 50-70%.

Установлено, что созревание ооцитов in vitro неравнозначно естест- венному, которое происходит в ооците in vivo до его овуляции. Как пока- зали многочисленные исследования, в условиях in vitro происходит созре- вание ядра без полноценного цитоплазматического созревания. Под цито- плазматическим созреванием понимают совокупность морфологических, биохимических и физиологических изменений в цитоплазме ооцита, в ре-

зультате которых яйцеклетка становится способной к оплодотворению и дальнейшемуразвитию.

Для окончательной оценки полноценности созревания нужно ооциты оплодотворить и наблюдать за ранним развитием эмбрионов до стадий поздней морулы или бластоцисты. Вследствие этого in vitro созревшие ооциты не способны к дальнейшему развитию после оплодотворения, т.к. в этом процессе существенную роль играют цитоплазматические факто- ры, ответственные за формирование структуры белков и мужского про- нуклеуса.

Опыты проведенные на овцах, убедительно показали, что на цитоплаз- матическое созревание ооцитов оказывают влияние не только клетки ку- мулюса (яйценосного бугорка), состоящего из фолликулярных клеток, но и определенные гормоны, в частности гонадотропные гормоны и эстради- ол. В этом случае созревшие in vitro ооциты приобретают способность не только к полноценному созреванию и оплодотворению, но и к последую- щемуэмбриональному развитию.

Под культивированием ооцитов in vitro понимают процесс созревания незрелых ооцитов в искусственных питательных средах, в которых незре- лые ооциты проходят мейотическое созревание до метафазы второго де- ления, т.е. до стадии готовности к оплодотворению.

Для выделения ооцитов из фолликулов, как правило, используют яич- ники от убитых коров и реже яичники, извлеченные оперативным путем. Если яичники берут от убитых коров, то их необходимо до извлечения ооцитов в течение не более 1,5-4 ч хранить в солевом растворе Хэнкса с добавление антибиотиков при температуре 200. После извлечения яичники отбирают. Со следами свежей овуляции, геморрагические, с фолликуляр- ными кистами выбраковывают. Наилучшие результаты получены при от-

91

боре яичников в стадии фолликулярного роста с использованием фолли- кулов диаметром 2-6 мм. Наиболее приемлем метод извлечения ооцитов из фолликулов путем рассечения их лезвием (аспирацией, пункцией). Яич- ники дважды или трижды промывают в стандартной среде (Бринстера, ТС-199, Дюльбекко) и под контролем стереомикроскопов отбирают ооци- ты с компактным кумулюсом.

Популяция ооцитов по своим характеристикам неоднородна, поэтому

необходимы оценка и отбор ооцитов по признакам жизнеспособности (морфологический метод оценки). Ооциты, пригодные для культивирова- ния, должны отвечать следующим требованиям: форма округлая; ооплаз- ма мелкозернистая, гомогенная, равномерно заполняет весь ооцит; про- зрачная оболочка опалесцирует, округлой формы; кумулюс компактный, многослойный, плотноприлегающий к ооциту, однородный.

Жизнеспособность фолликулярных ооцитов определяют с помощью флюоресцентных красителей. Широко используют для окраски голубой краситель Эванса, который не проникает внутрь ооцита и этим не снижает жизнеспособность клетки. Нежизнеспособные клетки окрашиваются че- рез 7-10 мин, в то время как жизнеспособные не окрашиваются. Ооциты, отвечающие требованиям культивирования, неоднократно промывают в среде ТС-199 на растворе Эрла с антибиотиками и ставят на культивиро- вание.

Разработано несколько способов культивирования ооцитов. Основные из них: культивирование в закрытых сосудах (флаконах); в чашках Петри в среде, покрытой слоем вазелинового масла; в сосудах с округлым дном, покрытых крышками. При любых способах культивирования необходи- мы: стерильность на всех этапах работы; газовая среда, включающая ди- оксид углерода (СО2), кислород и азот в различных соотношениях, отве-

чающих требованиям по поддержанию рН на уровне физиологического оптимума (7.3-7.5); температура для культивирования 390С при макси- мальной влажности. Наилучшие результаты по культивированию ооцитов получены в газовой среде при 5%-ной концентрации СО2 в воздухе.

Для культивирования ооцитов млекопитающих в зависимости от вида животных используют культуральные среды двух видов: простые и синте- тические. При культивировании ооцитов в простых средах можно изучить влияние различных биологических веществ, используемых в качестве до- бавок к средам, на созревание ооцитов. В синтетические среды добавляют сыворотку крови и другие биологически активные вещества. В этих сре- дах происходит созревание ооцитов in vitro до метафазы второго деления.

92

В качестве основных стандартных сред используют ТС-199; ХЭМ-Ф-10; В2- Менезо, МРМ.

Для получения полноценных ооцитов в эти среды добавляют гормоны ЛГ, ФСГ и эстрадиол или гомологическую сыворотку крови, полученную от коров в стадии эструса, т.е. перед овуляцией. В среду ТС-199 вводят кроме указанных гормонов 20% эмбриональной сыворотки крупного ро- гатого скота и антибиотики.

Во всех средах с указанными добавками 80% ооцитов достигают ста- дии метафазы второго деления созревания. Таким образом, во время со- зревания ооцитов in vitro полностью завершается первое мейотическое де- ление, а второе деление созревания большинства ооцитов заканчивается стадией мейоза метафазы II. Окончательное завершение мейоза происхо- дит после оплодотворения.

После извлечения ооцитов из антрального фолликула и помещения в культуральную средупроисходят первые морфологические изменения, свя- занные с ядерным созреванием ооцитов, т.е. мейоз возобновляется. Пер- вый морфологический признак созревания – разрушение зародышевого пузырька – ядра ооцита, т.е. профазное ядро ооцита преобразуется в мета- фазу. Таким образом, большинствоизвлеченных ооцитов, находящихся на стадии диплонемы, переходят в стадию диакинеза, что проявляется в раз- рушении ядерной оболочки.

После этого наблюдается конденсация хромосом, а биваленты, со- стоящие из двух гомологичных хромосом, визуализируются. Биваленты

располагаются симметрично по обе стороны экватора веретена первого мейотического деления. Затем в стадии анафазы I происходит разъедине- ние гомологичных хромосом, которые расходятся к противоположным полюсам веретена. В следующей стадии мейотического деления (телофаза I) одна из гомологичных хромосом остается в ооците, а вторая переходит в полярное тельце, т.е. образуются два дочерних ядра.

Первое мейотическое деление, являющееся редукционным, сменяется вторым эквационным делением, во время которого происходит деление хромосом как в митозе и формирование веретена деления из ахроматино- вых нитей. На этой стадии деления мейотическое созревание блокируется до оплодотворения ооцита. О завершении созревания ооцитов in vivo или in vitro судят по появлению полярного тельца или по достижению ооцита- ми метафазы второгоделения созревания.

Для контроля за динамикой созревания ооцитов применяют цитогене- тический анализ после различных экспозиций культивирования. Опти-

93

мальная продолжительность созревания ооцитов, когда 80% из них дости- гают стадии метафазы II, у основных видов сельскохозяйственных живот- ных составляет: у овцы 25 ч; у свиньи и лошади – 40 ч; у крупного рогато- го скота – 24-27 ч.

В процессе созревания ооцитов происходят изменения не только в яд- ре, но и в цитоплазме (синтезируются новые белки и происходит измене- ние белкового состава). Хотя высокий % извлеченных из фолликулов ооцитов в культуральной среде достигает метафазы II и, следовательно, по

состоянию хромосом ооцитыспособны к оплодотворениюи дальнейшему эмбриональному развитию, исследования показывают, что такие созревшие

яйцеклетки обладают минимальной способностью к оплодотворению и дальнейшемуэмбриональномуразвитию.

Причины такого явления кроются, вероятно, в сложности процессов созревания, которые протекают не только в изолированном ооците, но и включают все элементы фолликула. Так, если культивировать ооциты в неповрежденных фолликулах, то созревание и оплодотворение проходят нормально. Однако метод культивирования ооцитов в фолликуле в силу ряда причин не является перспективным для получения эмбрионов, на- оборот, культивирование изолированных ооцитов и клеток фолликула представляется перспективнымнаправлением.

Установлено, что в фолликуле между ооцитом и клетками кумулюса существует тесная связь. Надо полагать, что прочные связи между ооци- том и клетками фолликула способствуют созреванию ооцита. Однако при извлечении ооцита из фолликула эти связи нарушаются, что приводит к изменениям структуры ооплазмы и ее функций. Поэтому особое внима- ние уделяется проблеме созревания цитоплазмы ооцитов. Обнаружено,

что на стадии профазы мейоза в ооцитах интенсивно происходит синтез РНК, белков, рибосом, митохондрий и многих ферментов.

Интенсивный синтез, осуществляемый самим ооцитом, связан с актив- ностью генов и увеличением числа их копий. Установлено, что первые стадии эмбрионального развития проходят в условиях, когда ядро не гене- рирует РНК в цитоплазму, а процессом управляет РНК, накопленная в оогенезе. Следует отметить, что синтез РНК при культивировании ооци- тов значительно ниже, чем при их созревании в естественных условиях. Так, содержание РНК в ооцитах крупного рогатого скота, созревших in vitro до стадии метафазы II, на 20% ниже, чем в ооцитах, полученных из яйцевода коров после спонтанной овуляции.

94

Полученные результаты исследований показывают, что изменения в белковом синтезе связаны не с ядерным, а цитоплазматическим созрева- нием, имеющим решающее значение для нормального оплодотворения и

раннего эмбрионального развития вплоть до имплантации эмбриона в стенкуматки реципиента. В связи с этим разрабатываются методы активи- зации синтеза РНК и белка при созревании ооцитов in vitro. Предполагает- ся, что при созревании ооцитов in vitro в цитоплазме не полностью синте- зируется фактор, ответственный за формирование мужского пронуклеуса.

Процесс слияния половых клеток называют оплодотворением. В сере- дине XX века были разработаны условия для культивирования яйцеклеток млекопитающих in vitro, в которых могут происходить оплодотворение и предимплантационные этапы развития ранних эмбрионов. Это позволило приступить к детальному изучению взаимодействий яйцеклеток и спер- миев. Благодаря новой цитологической технике были раскрыты механиз- мыоплодотворения.

7.2. Капацитация спермиев. Чтобы спермии могли оплодотворить яйцеклетку, в них должны произойти изменения, характеризующие капа- цитацию, т.е. их готовность к оплодотворению. Под капацитацией (со-

зреванием, инкубацией) спермиев понимают комплекс физиологических и физико-химических изменений, в результате которых спермии приобретают способность проникать через блестящую оболочку и оплодотворять яйцеклетку. В естественных условиях капацитация про- исходит во время прохождения спермиев по генитальному тракту самки, где они отделяются от семенной плазмы. Капацитация может осуществ- ляться in vitro, если спермии будут находиться в определенных культу- ральной и газовой средах.

Для капацитации спермиев крупного рогатого скота разработаны куль- туральные среды: Кребса-Рингера и Тироде, Бринстера с высокой ионной силой, BVV, ТС-199 с 10% фетальной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота. В этих средах продолжительность капацитации спермиев составляет 8 ч.

Разработаны методы капацитации спермиев быка: центрифугирова- ние, седиментация и метод всплытия спермиев. Наибольшее распростра- нение получил последний метод, разработанный Парришем. Он заключа- ется в том, что после оттаивания и всплытия спермии капацитируют в специальной среде с 5 ед. гепарина.

Для экстракорпорального оплодотворения применяют глубокозаморо- женную сперму. После оттаивания спермы при t0 – 39 0С в течение 20 с

95

отделяют активные спермии от неподвижных в течение 1 ч по методу Парриша. Продолжительность совместной инкубации ооцитов и спермиев не превышает 24 ч. После такой инкубации ооциты и зиготы неоднократ- но промываются в модифицированном фосфатно-солевом буфере Дюль- бекко, чтобы освободиться от окружающих ооциты клеток кумулюса.

Особую проблему представляет объективная оценка капацитации спер- миев. Так как трудно охарактеризовать изменения белковых компонентов клеточных поверхностей сперматозоидов, блокирующих осуществление акросомной реакции, то в большинстве случаев для доказательства капа- цитации используют факт пенетрации (нарушения) блестящей оболочки ооцита. При этом особое значение придают двум факторам пенетрации – акросомной реакции и гиперактивации.

Процесс оплодотворения начинается с контактного взаимодей- ствия спермиев с поверхностью ооцита, а вернее, с прикрепления спер- миев к зоне пеллюцида. Каждый спермий имеет на своей поверхности множество белков «узнающих» соответствующие рецепторные молекулы в зоне пеллюцида ооцита. Связывание спермиев с зоной пеллюцида ви- доспецифично, т.е. рецепторы «узнают» спермии только того вида, к ко- торому они принадлежат. Полагают, что таким рецептором является гли- копротеин.

7.3.Акросомная реакция. После прикрепления спермиев к зоне пел- люцида происходит акросомная реакция. Акросома представляет собой органеллу спермия, богатую различными ферментами. При акросомной реакции наблюдаются структурные изменения плазматической и акро- сомной мембран, в результате которых освобождаются ферменты, обу- словливающие оплодотворяющую способность спермиев. Среди этих фер-

ментов наиболее важное значение имеют гиалуронидаза и акрозин. Фермент гиалуронидаза акросомы спермия освобождает ооцит от фолликулярных клеток и клеток яйценосного бугорка (2-3 мин.). Тем самым создаются условия для успешного продвижения спермиев. Фер- ментативный процесс, в котором участвуют гиалуронидоза и акрозин ак- росомы спермия, сопровождается преобразованием хромосом спермия из

компактного состояния в упорядоченное распределение и превращением их в пронуклеус самца в цитоплазме ооцита. Фермент акрозин активи-

рует подвижность спермия и способствует выделению хроматина из головки спермия, проникшего в цитоплазму ооцита. На втором этапе оплодотворения спермий погружается в протоплазму яйца акросомой, всей головкой и жгутиком.

96

Первая стадия акросомной реакции заключается в слиянии плазмати- ческой и наружной акросомной мембран, что позволяет освободиться ак- росомной жидкости с находящимися в ней ферментами. Ферменты раз- рушают зону пеллюцида, что позволяет спермию продвинуться в ооплаз- му ооцита. После этого происходит встраивание внутренней мембраны спермия в мембрану яйцеклетки. Из множества проникших сквозь зону пеллюцида ооцита спермиев лишь один сливается с плазматической мем- браной яйцеклетки и оплодотворяет ее и в итоге возникает зигота.

Среди множества факторов, которые могут вызывать индукцию акро- сомной реакции in vitro, выделяют ионы Са++ в культуральной среде. Свя-

зывание спермиев с гликопротеином яйцеклетки приводит к повышению проницаемости плазматической мембраны спермия для ионов кальция, что способствует слиянию плазматической мембраны с мембраной акро- сомы. Таким образом, гликопротеин выполняет две важные функции – связывание спермиев и индукцию акросомной реакции. В свободной от

ионов кальция культуральной среде хотя и может до известных пределов проходить капацитация, ноакросомная реакция блокируется.

Для цитологической оценки акросомной реакции разработаны цито- морфологические методы, фазово-контрастное освещение, окрашивание спермиев красителями и др. Например, существует биологический метод, позволяющий оценивать капацитацию и акросомную реакцию по способ- ности спермиев проникать в ооциты хомячка, лишенные прозрачной обо- лочки. При удалении механическим или ферментативным путем прозрач- ной оболочки с яйцеклетки в нее проникают все чужеродные спермии. Однако, спермии проникают в яйцеклетки в том случае, если они предва-

рительно культивировались в среде для индуцирования капацитации и акросомной реакции.

Указанный способ оценки акросомной реакции может быть использо- ван и для объективной оценки оплодотворяющей способности спермы. После слияния спермия с плазматической мембраной яйцеклетки его го- ловка теряет оболочки и хроматин начинает деконденсироваться. Измене- ние плазматической мембраны вызывает кортикальную реакцию прозрач- ной зоны ооцита. Она становится препятствием для проникновения дру- гих спермиев (блокада полиспермии).

Раскрытие механизма блокирования полиспермии имеет большое зна- чение для нормального оплодотворения в условиях in vitro. В условиях in vivo вероятность полиспермии существенно снижается, т.к. в часть яйце- вода, где происходит естественное оплодотворение, попадают лишь сотни

97

спермиев. При оплодотворении in vitro созревший ооцит окружен значи- тельно большим количеством спермиев, в результате чего частота поли- спермного оплодотворения может возрастать.

Проникновение спермия в яйцеклетку приводит к ее активации и об- разованию мужского пронуклеуса. Одновременно завершается мейоз, за- блокированный на метафазе второго деления. После завершения мейоти- ческого деления формируется женский пронуклеус. Пронуклеус спермия увеличивается и достигает размера женского пронуклеуса. Происходит сближение обоих пронуклеусов и объединение геномов, образуется общая ядерная оболочка. Образуется митотическое веретено и начинается первое деление дробления. От момента проникновения спермия в ооцит до пер- вого деления зиготы проходит около 12 ч.

Технология экстракорпорального оплодотворения сводится к сле- дующему. Ооциты коров, достигшие стадии созревания метафазы II, оп- лодотворяют капацитированными спермиями. Для этого созревшие ооци- ты освобождают от клеток кумулюса, используя механические или фер- ментативные способы.

Процесс экстракорпорального оплодотворения сложен и включает не- сколько стадий. Для контроля оплодотворения используют разные крите- рии, которые можно объединить в две группы. К первой группе критериев оплодотворения, оцениваемых цитологическим методом, относят: пенет- рацию спермиев, формирование пронуклеусов, сингамию и первую ста- дию дробления. Если использовать эти критерии, то у ряда видов сельско- хозяйственных животных в зависимости от качества созревших in vitro гамет оплодотворяемость составляет 50-70%. Если использовать более строгие морфологические критерии, такие, как образование морул, бла- стоцист и рождения потомков, оплодотворяемость снижается до 20%.

Основной причиной снижения способности к эмбриональному разви- тию in vitro оплодотворенных яйцеклеток является несовершенство куль- туральных сред для ранних эмбрионов, вследствие чего развитие эмбрио- нов блокируется на стадии 8-16 бластомеров. Если экстракорпорально

оплодотворенные ооциты коров проходили инкубацию в лигатированных яйцеводах кролика, овцы или коровы от 8-16 бластомерных эмбрионов до бластоцист, то в этом случае можно получить до 40% живых телят.

7.4. Получение эмбрионов из оплодотворенных in vitro ооцитов.

Конечная цель экстракорпорального оплодотворения созревших in vitro ооцитов – получение эмбрионов, пригодных для трансплантации. При куль-

тивировании ранних эмбрионов крупного рогатого скота в большинстве

98

случаев эмбриональное развитие блокируется на стадии 8-16 клеток, т.е. когда в естественных условиях эмбрионы переходят из яйцевода в матку.

Лишь единичные эмбрионы развиваются до стадий поздней морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации. В то же время установлено, что если культивировать in vitro ранние морулы, то можно получить высо- кий % бластоцист (60-80%) и даже выход эмбрионов из зоны пеллюцида. Инкубацию эмбрионов проводят двумя способами: в яйцеводе кролика, овцы или коровы и культуральных средах.

В 1983 г. во ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных жи- вотных был получен живой теленок из созревшего in vitro и экстракорпо- рально оплодотворенного ооцита. В эксперименте хирургическим методом трансплантировали ранних(2-4-клеточных) эмбрионов в яйцевод коровы.

Более совершенен метод, когда используют промежуточного хозяина или временного реципиента – овцу, кролика или корову. Это позволяет получить морулы или бластоцисты для нехирургической пересадки коро- вам – реципиентам. При этом с помощью перекрестного культивирования можно дважды проводить селекцию эмбрионов на жизнеспособность: пер-

вый раз перед пересадкой временному реципиенту и второй раз перед трансплантацией постоянному реципиенту. В зависимости от вида вре- менного реципиента выход морул и бластоцист составляет 23-73%. Более перспективным направлением исследований является получение эмбрио- нов in vitro на стадии поздней морулы или бластоцисты, пригодных для трансплантации эмбрионов нехирургическим методом в матку коровы – реципиента. Для культивирования эмбрионов in vitro разработаны культу- ральные среды. Установлено, что ранние эмбрионы очень чувствительны к изменениям осмотического давления среды и рН, поэтому для культи- вирования эмбрионов in vitro применяют хорошо сбалансированные пита- тельные среды: ТС-199, ХЭМ-Ф-10, МРМ, солевые растворы Дюльбекко, Брингстера с различными биологическими и синтетическими добавками. Среду меняют через сутки. Первый контроль за развитием зародыша про- водят через 24 ч после оплодотворения. Если оплодотворение прошло нормально, то можно обнаружить второе полярное тельце и борозду дроб- ления.

При цитогенетическом и гистологическом анализе выявляют анафазу II, сформированные мужской и женской пронуклеусы, синкарион, первое деление дробления. Сингамия, т.е. вступление в тесный контакт пронук- леусов, в результате чего происходит окончательное слияние мужской и женской гамет, наблюдается через 19 ч после экстракорпорального опло-

99

дотворения, первый митоз через 21 ч и образование двухклеточного эм- бриона через 22 ч.

Встандартных синтетических средах культивирования у большинства эмбрионов на стадиях 8-16 бластомеров наступает блокирование развития, что связано с несовершенством синтетических сред. Предполагают, что этот блок развития ранних эмбрионов можно преодолеть через культиви- рование эмбрионов на однослойных клеточных популяциях – монослоях.

Вкачестве таких однослойных клеточных популяций используют мо- нослой яйцевода, гранулезные клетки и клетки трофобласта эмбриона или амниона. В указанных клеточных популяциях предполагается наличие ростстимулирующегофактора, природа и синтез которогоизучаются.

Контрольные вопросы:

1.Расскажите о культивировании ооцитов вне организма животного.

2.Какие разработаны способы культивирования ооцитов?

3.Какие культуральные среды используют для культивирования ооцитов?

4.Чтотакое капацитация сперматозоидов?

5.Какие разработаны культуральные среды для капацитации спермиев?

6.Какие разработаны методы капацитации спермиев?

7.Чтотакое акросома и акросомная реакция?

8.Какую функцию выполняют ферменты глалуронидаза и акрозин?

9.Расскажите о технологии экстракорпорального оплодотворения ооцитов.

10.Расскажите, как получают эмбрионы из оплодотворенных вне организма ооцитов

ГЛАВА8.БИОТЕХНОЛОГИЯКОРМОВЫХПРЕПАРАТОВ

8.1.Получение кормовых белков. Белки являются обязательными

компонентами клеток любого живого организма, выполняющими жизненно важные функции: каталитические, регуляторные, транспортные, биоэнергетические, защитные от инфекции и действия стрессовых факторов, структурные, запасные и др.

В вегетативной массе растений на долю белков приходится 5-15% су- хого вещества, в зерне злаковых – 8-18%, семенах масличных растений –

100