Биотехнология в животноводстве

Контрольные вопросы:

1.Какие ферменты генетической инженерии Вы знаете? С какой целью их используют в генетической инженерии?

2.Расскажите о конструировании и технологии рекомбинантных ДНК.

3.Чтотакое вектор и каковы основныетипы векторов?

4.Что является определяющим при выборе вектора для клонирования?

5.Какие требования предъявляются к векторной молекуле? 6.Кем и как впервые осуществлен химический синтез гена? 7.Как проводится выделение и ферментативный синтез генов? 8.Как осуществляется гибридизация соматических клеток?

9.Расскажите о генетической инженерии на уровне хромосом и геномов.

ГЛАВА3. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

3.1.Технология трансплантации эмбрионов. Трансплантация эмбрио-

нов сельскохозяйственных животных – биотехнологический метод вос- производства, позволяющий увеличить темпы воспроизводства и повы- сить эффективность племенной работы. Наиболее приемлемы для транс- плантации эмбрионов малоплодные виды животных: коровы, лошади, ов- цы. В мировой практике животноводства метод трансплантации эмбрио- нов в большей степени применяется в молочном и мясном скотоводстве. Используя реципиентов для пересадки эмбрионов, полученных от одной отобранной коровы – донора, можно увеличить число ее потомков в де- сятки и сотни раз. Теоретически от генетически выдающейся коровы – донора за всю ее жизнь можно получить не менее 500 телят.

В трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота сделан огром- ный прогресс, вследствие чего этот метод занял прочное место в совре- менных программах селекции. Метод трансплантации вместе с искусст- венным осеменением рассматривается как основа современной биотехно- логии воспроизводства высокопродуктивных племенных животных. Тех- нология трансплантации эмбрионов включает ряд последовательных эта- пов: отбор доноров; проведение суперовуляции у доноров; отбор произво- дителей и осемение доноров; извлечение эмбрионов и их оценка; культи- вирование или замораживание эмбрионов; отбор и подготовку реципиен- тов; пересадку эмбрионов реципиентам; оценку результатов транспланта- ции.

41

Отбор доноров. В селекционных программах отбору доноров прида- ется огромное значение. Наиболее важным критерием на первых этапах отбора коров доноров служит их высокая племенная ценность, то есть способность передавать гены высокой продуктивности своим потомкам. В большинстве случаев в качестве коров – доноров отбирают матерей по- тенциальных племенных быков. Племенная ценность донора должна под- тверждаться не только высокой продуктивностью самой коровы, но и ее родственников. Отбор доноров производится в племенных хозяйствах, глав- ным образом, в племенных заводах, имеющих высокий уровень молочной продуктивности. В группу доноров, отобранных в качестве матерей бы- ков, включают лучших коров племенных стад. Поэтому селекционный дифференциал, являющийся одним из главных показателей расчета ожи- даемого генетическогоэффекта селекции, будет всегда высоким.

Сначала племенную ценность коровы – донора определяют по ее соб- ственному фенотипу. Например, по таким экономически важным призна- кам, как молочная продуктивность, качество молока и так далее. Наряду с

молочной продуктивностью для отбора доноров в зависимости от породы устанавливают минимальные требования по другим селекционным при- знакам, таким, как содержание жира и белка в молоке, пригодность коров к машинномудоению, крепость конституции и экстерьер.

Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. Как показывают исследования, из-за плохой воспроизводительной функции до50% коров с высокой племенной ценностью непригодны для воспроизводства полно- ценных эмбрионов. Потенциальные коровы – доноры с хорошими и ус- тойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрас- положенностью к воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые 2 месяца.

Большинство исследователей считает, что интегральным показателем

воспроизводительной способности коров является межотельный период (МОП). Если исходить из общепринятого положения, что от коровы нуж- но получить одного теленка в год, то МОП в среднем не должен превы-

шать 365 дней. МОП включает два показателя – сервис – период и период стельности. Сервис – период более точно выявляет потенциальные воз- можности воспроизводительной функции коров. Он тесно связан с МОП (r = 0,9). Если исходить из того, что продолжительность эмбрионального периода у коров в среднем составляет 285 дней, то, следовательно, опти- мальный сервис – период не должен превышать 90 дней. В этот период

42

корова должна быть оплодотворена. Такой оптимальный биологически оправданный сервис – период позволяет получать от коровы по одному теленкув год.

Сервис – период в основном зависит от интервала между отелом и пер- вым осеменением и интервала между первым и последним. Период от отела до первого осеменения определяется биологическими и хозяйствен- ными факторами. С биологической точки зрения этот период зависит

главным образом от инволюции матки и выраженности у коров половой охоты. Срок завершения инволюции матки колеблется в пределах 26-52 дней. В то же время первая овуляция у молочных коров наступает значи- тельно раньше – с 10-х суток после отела. При хороших условиях кормле- ния и правильной технологии содержания гинекологически здоровых ко- ров можно осеменять в первый месяц после нормального отела. Однако, высокопродуктивных коров целесообразно осеменять на втором месяце. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, поло- вая охота клинически плохо определяется или вовсе необнаруживается.

Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис – и межотельный периоды. При оптимальном сервис – периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность МОП не превышает 365 дней.

Для оценки воспроизводительной способности коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие пара- метры, как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осемене- ния. При правильной технике осеменения и своевременном определении

половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%. Важным показателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения, то есть количество осе- менений на одно оплодотворение. Низкая оплодотворяемость коров от

первого осеменения и высокий индекс осеменения указывают на плохую воспроизводительную способность коров. Индекс осеменения коров, вы- деляемых в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае потенциальная корова – донор должна иметь индекс осеменения, равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутст- вовать осложнения (мертворождаемость, задержания последа, послеродо- вые заболевания половых органов).

3.2. Проведение суперовуляции у доноров. При суперовуляции (мно-

жественная) выходит большее количество яйцеклеток, чем при обычной.

43

Суперовуляцию проводят у одноплодных животных с целью увеличения количества получаемых эмбрионов. Для увеличения количества созре-

вающих фолликулов у самок сельскохозяйственных животных используют фолликулостимулирующие гормоны (простагландины, эстро-

фан, эструмат, матазин и др.). Метод разработан М.М.Завадовским. Он установил, что при введении СЖК (сыворотки жеребых кобыл) у самок возрастает количество созревающих фолликулов.

Степень суперовуляции зависит от дозы СЖК – гормональногопрепа- рата, представляющего нормальную стерильную сыворотку кобыл, полу- ченную в период от 40 до 100 дней жеребости. Главный недостаток СЖК

– сильная антигенность, возможна резко выраженная аллергическая реак- ция. Выпускают препараты СЖК высокой степени очистки (фоллигон,

интергонан,малотропин).

Гипофизарный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) получа-

ют из гипофизов сельскохозяйственных животных. Основное действие ФСГ – стимуляция множественного роста фолликулов. ФСГ из гипофиза овец содержит примесь лютеинизирующего гормона (ЛГ) до 0,6 ед. мг, из гипофиза лошадей – 0,16 ед./мг. Овуляция происходит при совместном действии ФСГ и ЛГ. Оптимальная доза ФСГ для гормональной обработки доноров – 32-50 мг.

В экстрактах гипофиза содержится несколько гетерогенных форм ЛГ, которые влияют на развитие фолликулов, секрецию эстрогенов, формиро- вание желтого тела, продуцирование им прогестерона. При гормональной обработке коров – доноров ЛГ используют вместе с ФСГ в объеме 20% общей дозы ФСГ.

Гонадотропин – рилизинг гормон образуется в передней доле гипоталамуса, вызывает выделение ФСГ и ЛГ из гипофиза. Технология трансплантации эмбрионов предусматривает применение гормона про- гестерона и антисыворотки СЖК. Прогестерон стимулируется желтым телом и активизирует процессы в матке для сохранения беременности.

Антисыворотка СЖК применяется для сокращения действия СЖК при гормональной обработке доноров. ДействиеСЖК длится около50-60- дней, что снижает качество получаемых эмбрионов. Антисыворотку СЖК получают методом иммунизации овец, коз, кроликов очищенной СЖК. Наиболее активная сыворотка получается при иммунизации коз.

Коровы – доноры по-разному реагируют на гормональную обработку. Принято всех коров – доноров разделять на три группы: хорошо реаги- рующие, удовлетворительно реагирующие, практически не реагирующие.

44

Суперовуляторные качества доноров можно оценить по первой гормо- нальной обработке, вероятность оценки составляет 0,6-0,8. При отборе

доноров непосредственно в хозяйстве необходимо первую гормональную обработку провести на месте и только по полученным данным решать во- прос о переводе животных в группу доноров. Достоверные суперовуля- торные качества доноров точно оценить можно только на основании мно- гократных гормональныхобработок.

На суперовуляторную реакцию доноров существенное влияние ока- зывают: качество гормона, его доза, стадия лактации, характер течения предшествующих родов и послеродового периода, продуктивность, сезон, порода. Положительную реакцию можно ожидать, когда к моменту гор-

мональной обработки в яичниках коровы функционирует желтое тело диаметром 1,5 см.

Наибольшее распространение для суперовуляции у коров получили гормоны СЖК с простагландинами. Оптимальной считается доза СЖК (интергонан, малотропин, фоллигон и др.) 2500-3000 МЕ. При такой дозе получают до девяти овуляций. Эффективно введения СЖК между 10-ми –12-ми сутками эстрального цикла и через 48 ч - простаглан- дина, вызывающего регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. Через 48 ч после введения простагландина у 95% коров – доноров проис- ходит полиовуляция. Овулируют в среднем 10 яйцеклеток. Их оплодотво- ряемость достигает 80% и более. Возможно применение аналогов про- стагландина-эстрофана, фоллигона и др. Хороший эффект достигается при введении ФСГ, выделяемого передней долей гипофиза. Гормон ФСГ в комбинации с ЛГ вводят в соотношении 5:1 многократно. Доза ФСГ 3250 мг на донора. Многократная обработка гормоном ФСГ с интервалом в 45-60 дней не снижает суперовуляторные качества коров-доноров. Одна- ко, некоторые коровы (3-5%) характеризуются отрицательной реакцией к многократной гормональной обработке.

Установлено, что от доноров в течение года можно получать эмбрио- ны пять раз с интервалами в 45-65 дней при вымывании в среднем по 5-6 эмбрионов за один цикл. Однако при обработке СЖК при повторных вы-

мываниях процент оплодотворяемости яйцеклеток снижается почти в два раза. При обработке СЖК частообразуются кисты яичников.

Эффективность суперовуляции в последующем определяется эффек- тивностью искусственного осеменения коров – доноров. При этом только 60-65% получаемых эмбрионов пригодны для пересадки реципиентам. Остальные 35-40% составляют яйцеклетки или дегенерированные эм-

45

брионы. Эффективность осеменения свежеполученной спермой выше, чем замороженной. Для осеменения используют сперму производителей первой племенной категории. При отборе быков их оценивают по карио- типу с целью исключения хромосомных аномалий. Потомство отобран- ных производителей не должно иметь экстерьерно -конституциональных дефектов. Сперма производителей, отбираемых для осеменения, должна характеризоваться наивысшей оплодотворяемостью, не ниже 85-90%. Ес- ли оплодотворяющая способность спермы быка составляет 60% и менее, то его выбраковывают.

Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, на- ряду с использованием высококачественной спермы, необходимо опреде- лить сроки половой охоты для своевременного проведения искусственно- го осеменения. Установлено, что гормонально индуцированная половая охота длится в среднем 24 ч, хотя у отдельных коров она может продол- жаться и дольше.

Имеются разные мнения специалистов о времени и кратности осеме- нения коров с гормонально вызванной половой охотой. В зарубежных стра- нах, как правило, таких коров осеменяют дважды: первый раз в начале появления половой охоты и второй – через 12-24 ч. В нашей стране коров

– доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом 10-12 ч. Так как при суперовуляции повышается число овулировавших яйцекле- ток, в каждой дозе спермы должно быть не менее 50 млн. подвижных спермиев.

Для искусственного осеменения коров – доноров применяют три спо- соба: визоцервикальный (с использованием влагалищного зеркала); мано- цервикальный (введение во влагалище руки в перчатке и укороченной пи- петки); ректоцервикальный (с фиксированием шейки матки и контролем продвижения осеменительной пипетки с помощью руки, введенной в пря- мую кишку). Самую высокую эффективность искусственного осеменения коров-доноров обеспечивает ректоцервикальный способ.

3.3. Извлечение и оценка эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя спо- собами: после убоя коровы-донора, хирургическиминехирургическим.

а) Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убой коровы-до- нора. Известно, что яйцеклетки после овуляции и оплодотворения на чет- вертые сутки переходят из яйцепроводов в рога матки. Следовательно, если зиготы извлекать не позднее, чем трое суток после искусственного

46

осеменения, то достаточно промыть лишь яйцепроводы, в которых нахо- дятся ранние эмбрионы. Для вымывания достаточно20-25 мл питательной среды. Необходимо помнить, что время между убоем донора и вымыва- нием эмбрионов не должно превышать 30-40 мин., то есть эмбрионы

должны быть получены до начала процесса клеточного переваривания в половых органах.

б) Извлечение эмбриона хирургическим способом. Извлечение эм-

брионов хирургическим способом применяли в 70-е годы. Для трансплан- тации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы из- влекают между 7-ми -–8-ми сутками после первого искусственного осе- менения.

Имеется несколько способов хирургического извлечения эмбрионов:

разрез верхнего свода влагалища; лапаротомия (вскрытие) по белой линии живота; лапаротомия в области голодной ямки.

Хирургический способ извлечения эмбрионов более трудоемок; необ- ходимы высокая квалификация хирурга, операционный зал и стерильные условия и особенно важно, им нельзя пользоваться многократно.

в) Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Катетерный

(нехирургический) способ извлечения эмбрионов практически не вызыва- ет каких-либо осложнений в организме животного. Катетерным способом можно успешно извлекать эмбрионы в животноводческом помещении. Эффективность способа высока, повторность многократна. С помощью катетерного способа получают в среднем 4.3 эмбриона от 86% коров – доноров. Вымывают эмбрионы на 7-8 сутки после осеменения. Для вымы- вания используют специальную питательную среду Дюльбекко. Продол- жительность манипуляции 20-50 мин.

Для получения эмбрионов этим способом разработаны специальные катеторы, система биологически нейтральных шлангов, сосуды для спе- циальной среды и приема промывной среды с эмбрионами. Промывную среду вводят в рога матки и удаляют из них с помощью шприца. Фракци- онное (5-6 раз) промывание рогов матки обеспечивает извлечение до 76% эмбрионов.

Оценка эмбрионов. Перед пересадкой реципиенту необходимо оце- нить качество эмбриона, определить способ его пересадки. Оценивают эм- брионы различными методами. Основными из них являются: морфологи- ческий и метод окраски эмбрионов. Считается, что степень точности мор- фологического метода может быть доведена до 90% и более. Качество или

47

жизнеспособность эмбрионов оцениваются на 7-8 сутки по степени разви- тия их до бластоцисты.

При морфологической оценке особое внимание обращают на внеш- нюю форму зиготы, состояние зоны ее пеллюцида, число бластомеров, рав- номерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта, чет- кость в очертании клеток, вакуализацию цитоплазмы – просветление ее периферии, целостность клеточной мембраны и выход цитоплазмы нару- жу. Оценивают под микроскопом при 100-160 кратном увеличении.

Существует несколько систем морфологической оценки эмбрионов. Трехбалльная система: 3 – нормальные; 2 – поврежденные; 1 – дегенери- рованные. Четырехбалльная система: 4- превосходные; 3- хорошие; 2 – посредственные; 1 – плохие. В России принята пятибалльная шкала оцен- ки качества эмбрионов, учитывающая: целостность прозрачной оболочки; равномерность дробления; состояние цитоплазмы; прозрачность периви- теллинового пространства; соответствие стадии развития.

Метод окраски эмбрионов основан на способности красителей окра- шивать морфологические структуры живой и мертвой клетки. Прижиз- ненную окраску эмбрионов проводят нетоксичными диффузными краси- телями, равномерно окрашивающими клетки. Живая клетка в неповреж- денном состоянии практически не окрашивается кислыми красителями.

3.4. Пересадка эмбрионов реципиентам. В качестве реципиента от-

бирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов с хорошими воспроизводительными качествами. Про- дуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотво- ряемостью после первого осеменения могут плохо приживляться эмбрио- ны. В среднем на одного донора отбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями.

Результаты пересадки эмбрионов у коров бывают высокими только в том случае, если день овуляции у доноров и реципиентов совпадает по вре- мени. Для этого проводят групповую синхронизацию половой охоты. Счи- тается, что расхождение в синхронизации не должно превышать ± 12 ч. Для синхронизации охоты используют простагландин и его аналоги. Одна из широко применяемых схем синхронизации охоты следующая: в пер- вый день вводят тривитамин (15 мл.), на 10-й и 21-й день – эстрофан (по 500 мкг), тривитамин (по 15 мл) и биостимуляторы (кровь по 40-60 мл или молозиво по 10-20 мл и др.) Эмбрионы овцы могут быть пересажены без

48

снижения эффективности приживляемости при расхождении половой охоты донора и реципиента в 24-48 ч.

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При хирургическом спосо- бе пересадки эмбрионов применяют лапаротомию (вскрытие) по белой линии живота или в области подвздоха. Лапаротомию проводят под об- щим наркозом при спинном положении животного. Длина разреза по бе- лой линии живота составляет 10 см. Через разрез выводят наружу верхний отдел рога матки и стенку его прокалывают тупой иглой. Стеклянную пи- петку, в которой находится эмбрион, вводят через отверстие внутрь рога матки, затем выдавливают эмбрион вместе со средой. При некотором на-

выке специалиста продолжительность хирургической пересадки эмбриона составляет не более 10-15 мин. Эффективность хирургического способа пересадки эмбрионов составляет 60-70%, а число телят 3-4 на донора.

В последние 10-15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществля- ют нехирургическим способом. Основным преимуществом этого способа кроме простоты и большой экономичности, является возможность много- кратного использования реципиента. Разработано несколько спо собов не- хирургической пересадки эмбрионов. Однако, все они основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.

После необходимых обработок инструмента и наружных половых ор- ганов катетер, в котором находится пайетта с эмбрионом, осторожно вво- дят до шейки матки и под ректальным контролем проводят через церви- кальный канал, глубоко в рог матки ближе к его верхней части и выталки- вают эмбрион вместе со средой в просвет рога матки. После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охо- ты.

Для установления стельности у коров-реципиентов используют не- сколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или моло- ке; клинический, главным образом, ректальным путем. При визуальном контроле обращают внимание на 7-12-е сутки после пересадки эмбрионов. Определение уровня прогестерона в крови или молоке реципиентов про- водят через 14-18 суток после пересадки эмбрионов. Этот метод позволяет диагностировать стельность с точностью не менее 85%, а отсутствие бе- ременности – до 99%. На 60-е сутки после пересадки эмбрионов реципи- ентов исследуют на наличие стельности ректальнымспособом.

49

Особого внимания заслуживает такой прием, как нехирургическая пе-

ресадка двух эмбрионов по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот прием может быть при- менен для повышения частоты рождения разнояйцовых (дизиготных) двоен. Он позволяет получать двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем, то есть селекцией. Ре- зультаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возмож- ность увеличить выход новорожденных телят на 30%.

Можно пересаживать эмбрион и оплодотворенной корове. Средняя приживаемость эмбриона в осемененной корове при нехирургической под- садке составляет 50%. Такой метод позволяет получить более 50% двоен.

Внедрение в практику племенных хозяйств методов трансплантации эмбрионов и увеличения многоплодия коров обусловливает необходи- мость определения происхождения телят. Для этого широко используют группы крови животных. Кодоминантный характер наследования групп крови и неизменяемость в течение всей жизни особи позволяют использо- вать их на практике в качестве маркеров. С помощью групп крови можно маркировать 12 из 30 имеющихся в геноме у крупного рогатого скота хромосом, контролировать те хозяйственно-полезные признаки, гены ко- торых сцеплены с этими хромосомами.

Если биохимический признак у родителей отсутствует, то его не мо- жет быть и у потомка, так как каждый потомок наследует один аллель от отца, другой – от матери. В сомнительных случаях исследуют группу кро- ви у реципиента. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев.

3.5. Криоконсервация эмбрионов. С момента извлечения эмбриона и до его пересадки проходит от 2-3 до 20-24 ч. Оптимальная температура кратковременного хранения эмбрионов 8-120С, продолжительность хра- нения 3-4 суток. Скорость охлаждения должна быть медленной, чтобы исключить явление температурного шока. Для кратковременного хране-

ния и культивирования эмбрионов используют синтетические среды с различными белковыми добавками: бычий сывороточный альбумин, сы- воротку крови хряков – кастратов и нормальную сыворотку бычков – ка- стратов.

Кратковременное хранение в половых органах промежуточного реци- пиента практикуют после реконструкции эмбрионов и для транспорти- ровки на дальнее расстояние. В качестве промежуточных реципиентов

50