Биотехнология в животноводстве

популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, которые ус- тойчивы к ряду кровепаразитарных заболеваний.

Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком, как, например, некоторые африканские породы крупного рогатого скота, кроме резистентности к заболеваниям, отличаются хорошей жаровынос- ливостью и нетребовательностью к условиям содержания и кормления. Вместе с тем, имеются механизмы резистентности, которые основывают- ся на единичных генах, как, например, резистентность к диарее у новоро- жденных поросят, обусловленная Е.Coli, или резистентность к гриппу у мышей. Это послужило основанием для получения трансгенных живот- ных с чужеродными генами, которые, возможно, обеспечат невосприим- чивость таких животных к отдельным заболеваниям.

Одним из примеров гена резистентности является ген Mx мыши. Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Этот ген был выде- лен, клонирован и использован, в частности, для получения трансгенных свиней, которые экспрессировали ген Mx на уровне РНК. Однако, пока не получено данных об экспрессии у трансгенных свиней гена Mx и доказа- тельства резистентности трансгенных свиней к вирусу гриппа.

В Голландии исследуется возможность получения трансгенных жи- вотных, способных повысить содержание лактоферина в тканях молоч- ной железы с целью повышения резистентности к маститу.

Большой интерес представляют исследования по получению трансген- ных животных с генами антисмысловой РНК. Была создана конструкция

гена антисмысловой РНК против аденовируса и получены трансгенные кролики, которые на 90-98% имели более высокую резистентность против аденовируса по сравнению с контролем. В других экспериментах была

достигнута устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК против лейкоза крупного рогатого скота, к заражению вирусом лей- коза. В частности, получены трансгенные куры, устойчивые к вирусу лей- коза.

Приведенные выше данные открывают реальные перспективы повы- шения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.

Применение техники трансгеноза для улучшения состава молока.

Одним из наиболее эффективных путей снижения стоимости производст- ва молочных продуктов и расширения рынка может быть улучшение со- става молока путем получения трансгенных животных. В результате гене-

тической селекции в последние десятилетия молочная промышленность

61

достигла значительного улучшения качества молочной продукции. Одна- ко, новые генетические успехи, основанные на традиционных методах се- лекции, слишком медленны вследствие длительного интервала между по- колениями. Это ограничивается также низкой наследуемостью этих ка- честв.

В то же время эффективность молочной железы в качестве биореакто- ра настолько высока, что стоимость продукции может быть многократно снижена. Однако, не только фармацевтические белки могут быть эффек- тивно произведены в молочной железе. Биологически активные пептиды могут быть также получены с достаточно высокой эффективностью. В ближайшем будущем могут быть получены с молоком трансгенные про- дукты, которые могли бы стать источником заботы о человеческом здоро- вье.

С экономической точки зрения представляет интерес увеличения со- держания казеина в молоке, в связи с его влиянием на производство сыра. Считается, что молочная железа имеет ограничения в способности синтеза белка. Но имеется другой возможный путь увеличения уровня казеина, а именно, торможение производства других белков, представляющих ме- ньший интерес. Для этой роли подходит β-лактоглобулин. Этот белок при- сутствует только в молоке жвачных и является основным аллергеном мо- лока коров. Поэтому уменьшение его количества могло бы улучшить со- став молока.

В Австралии разрабатывают проект пересадки новых генов, коди- рующих два фермента. Эти ферменты ответственны за синтез аминокис- лот – цистина и метионина, необходимых для роста шерсти. Недостаток указанных аминокислот в организме овцы лимитирует рост шерсти.

Трансгенные сельскохозяйственные животные – продуценты биологически активных веществ и медицинскихпрепаратов. Трансгенных сельскохозяйственных животных используют для продуцирования чело-

веческого инсулина. Инсулин – белковый гормон, вырабатываемый под- желудочной железой. Недостаток его в организме приводит к сахарному диабету. Используя методы генной инженерии, инсулин можно синтези- ровать в микроорганизмах.

Экспериментально было показано, что ген инсулина человека, введен- ный в геном мыши, функционируют в мышиных клетках поджелудочной железы. Другими словами, ген инсулина человека проявляет себя в орга- низме мыши, как егособственный.

62

ВГермании разработана программа по созданию рекомбинантной ДНК,

вкоторой регуляторной областью является элементы гена коровьего белка, вырабатываемого в клетках молочной железы, а кодирующей об-

ластью – ген инсулина человека. По подсчетам немецких специалистов, использование лишь 10-20 молочных коров в качестве биоконверсионной системы позволит полностью удовлетворить потребность населения стра- ны в инсулине, которая составляет 400 кг в год.

ВРоссии в институте молекулярной генетики РАН проводились экс-

перименты по введению гена инсулина человека в генетический аппарат кроликов и овец.

Другой проект связан с получением фактора свертываемости крови человека из молока трансгенных овец и коров. В частности, фактор свер-

тываемости крови человека (F IX) типа применяется в фармакологии для

лечения гемофилии. Выявлены три типа гемофилии, два из которых обу-

словлены рецессивными сцепленными с полом генами, а один – крайне ред- кий – определяется рецессивным аутосомным геном.

Факторы свертываемости крови – дорогостоящие медицинские препа- раты, поэтому использование трансгенных животных в качестве «биоре- актора» для производства такого чистого медицинского препарата пред- ставляет большой интерес. Исследователи Р.Ланд и А.Кларк создали ре-

комбинантную ДНК, которая состояла из промотора лактоглобулина и ДНК гена IX фактора свертываемости крови человека. Рекомбинантная ДНК была инъецирована в зиготу овцы. Из таких реконструированных зигот были получены трансгенные овцы, содержащие в геноме интегри- рованный чужеродный ген. Однако, экспрессии этого гена не было выяв- лено.

Позднее таким методом было получено шесть овец, трансгенных по фактору свертываемости крови и антитрипсина. У этих овец чужеродный ген экспрессировался, а вырабатываемые продукты секретировались в вымя овцы вместе с белками молока.

Получение трансгенных животных с высокой плодовитостью. Пло-

довитость относится к полигенным признакам. Однако, на ее формирова-

ние и уровень оказывают влияние в основном два гонадотропных гормона

– ФСГ (фолликулостимулирующий) и ЛГ (лютеинизирующий), которые находятся под генетическим контролем. Предполагается, что если ввести такие гены в зиготу, то полученные трансгенные животные будут отли- чаться генетически повышенной плодовитостью.

63

Известно, что если животному ввести экзогенный гормон ФСГ, то это приведет к созреванию дополнительных яйцеклеток, и, как следствие, к повышениюплодовитости.

Одним из факторов яичника, подавляющих секрецию ФСГ, является ингибин – гонадный гормон. Этот гормон позволяет регулировать уровень ФСГ независимо от секреции ЛГ. Ожидается, что при инъецировании в

зиготу коровы гена ингибина и его экспрессии полученные трансгенные коровы будут характеризоваться наследственно обусловленной секрецией ФСГ.

В овцеводстве представляют интерес изучение, выделение, клониро- вание и введение в геном гена многоплодия породы овец бурула. Ген бу-

рула специфичен для одноименной породы овец с высокой наследственно обусловленной плодовитостью. При скрещивании с другими породами у помесей отмечены повышенная овуляция и плодовитость. Предполагает- ся, что ген бурула относится к типу главных генов – олигогенов. В на- стоящее время проводится изучение структуры этогогена.

4.3.Получениетрансгенныхсельскохозяйственныхживотных.

Получение трансгенных кроликов. В опытах по получению транс-

генных кроликах была использована конструкция чужеродной ДНК, со- стоящая из протомора металлотионеина мыши и структурной части гор- мона роста человека. Частота интеграции гена гормона роста человека со- ставила 12.8%. Она оказалась более чем в два раза ниже, чем у мышей, где

частота интеграции чужеродного гена гормона роста человека была на уровне 27%.

Получение трансгенных овец. В 1986 г. австралийскими учеными бы- ла получена трансгенная овца. В этом эксперименте использовали овечий ген гормона роста с металлотионеиновым промотором. Через 5 недель

после рождения трансгенному ягненку в рацион ввели небольшую дозу цинка, который включил в работу ген, активирующий регуляторную по- следовательность рекомбинантной ДНК. Этот дополнительный прием при- вел к более интенсивному синтезу гормона роста. Через 3 года после рож- дения трансгенная овца в 1,5 раза превосходила по массе сверстников той же породы. Цель таких опытов – создание интенсивно растущих транс- генных овец свысокой шерстной продуктивностью.

Получение трансгенных свиней. Для визуализации пронуклеусов в зиготах свиней применяют центрифугирование. После такой обработки зигот проводят микроинъекцию генов в пронуклеусы зигот. Установлено, что после микроинъекции рекомбинантной ДНК 10-20% инъецированных

64

зигот продолжают развиваться до стадии бластоцисты и 6-11% после пе- ресадки реципиентам дают трансгенных свиней. В среднем частота инте- грации чужеродного гена усвиней составляет 10%.

Первые эксперименты по получению трансгенных свиней были связа- ны с инъецией гена гормона роста человека с металлотионеиновым про- мотором в пронуклеусы яйцеклеток от суперовулированных свинок. Од- нако, несмотря на экспрессию гена гормона роста, увеличения живой мас- сы или стимуляции роста не наблюдалось.

В аналогичном эксперименте был использован ген гормона роста сви- ньи с промотором гена металлотионеина человека. У одной из шести по- лученных трансгенных свиней среднесуточный прирост составил 1273 г и в 17 недель ее живая масса достигла 90 кг. В то же время у контрольных свиней этот показатель был достигнут лишь в 22-25 недель. Отмечено, что при кормлении по стандартным рационам повышенного роста у трансген- ных свиней не происходит. Однако, у трансгенных свиней, в рационе ко- торых белок составлял 18%, живая масса увеличилась на 23%, усвояе- мость корма на 18%, толщина шпика уменьшилась более чем в два раза по сравнению с обычными сверстниками. Установлено отрицательное влия- ние чужеродных генов на некоторые физиологические функции. Так, трансгенные свиньи чаще предрасположены к летаргии и артриту, имеют плохой аппетит.

Получение трансгенного крупного рогатого скота. У крупного ро-

гатого скота зиготы содержат большое количество включений, поэтому трудно провести визуализацию пронуклеусов. Использование центрифу- гирования яйцеклеток позволяет определить гранулы, покрывающие про- нуклеусы.

Впервые в мужской пронуклеус зиготы коровы инъецировали реком-

бинантную ДНК, состоящую из гена МТ-1 мыши и гена тимидинкиназы вируса герпеса. Через 24 ч после инъекции ДНК у 30% ранних эмбрионов был обнаружен высокий уровень активности гена вируса герпеса.

В. Кирк инъецировал в зиготы коров конструкцию гена альфа-фе- топротеина. Из исследованных 116 эмбрионов у четырех была обнару- жена интеграция чужеродного гена. Из инъецированных зигот получено 10.9% новорожденных телят, в то время как у интактных эмбрионов этот показатель составил 42.8%. В 1988 г. российские и немецкие ученые инъ- ецировали в 513 зигот крупного рогатого скота три различные вирусные конструкции с геном гормона роста крупного рогатого скота и у 14 эм- брионов обнаружили чужеродную ДНК. От трансплантации 43 инъециро-

65

ванных эмбрионов у 14 реципиентов была зарегистрирована стельность. Родились 14 телят, один теленок был идентифицирован как трансгенный.

Контрольные вопросы: 1.Чтотакоетрансгеноз?

2.Какие методы используют для переноса генов млекопитающих?

3.Как осуществляется перенос генов методом микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы?

4.Каковы методы выявления интеграции чужеродного гена в молекулу ДНК?

5.Как осуществляется инъекция трансформированных эмбриональных столовых клеток в эмбрион?

6.Какие цели преследуются при создании разных типов трансгенных животных?

7.Какова роль трансгеноза в получении трансгенных животных с новыми хозяйственно-полезными признаками?

8.Каковы возможности получения трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям?

9.Какие преимущества имеют трансгенные животные по сравнению с рекомбинантными микроорганизмами и клеточными линиями млекопитающих в получении ценных фармакологических веществ?

10.Расскажите о получении трансгенных сельскохозяйственных животных.

11.Как молочная железа может быть использована в качестве "биореактора" для синтеза коммерческих продуктов?

ГЛАВА5. КЛОНИРОВАНИЕСЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

5.1. Пересадка ядер соматических клеток в энуклеированную яй-

цеклетку. Новые комбинации генов, возникающие на основе механизмов кроссинговера, редукционного деления, случайного распределения гамет при мейозе и слияния яйцеклетки и спермия, проявляются в процессе со- зревания гамет и их оплодотворения. При этом распределение генов по гаметам в процессе созревания последних происходит случайно и подчи- няется законуменделевскогорасщепления.

Таким образом, механизм полового процесса направлен на поддержа- ние необходимого генетического разнообразия в популяции животных. В

66

то же время половой процесс, обеспечивая для сохранения и эволюции популяции генетическое разнообразие, препятствует точному воспроизве- дению и размножению генетически ценных животных, создаваемых в ре- зультате целенаправленной многолетней селекционной работы. Такие вы- дающиеся животные не передают потомкам ценные генетические комби- нации. Поэтому в селекции и разведении животных возникает важная проблема – разработка методов получения потомков, которые были бы точной генетической копией выдающихся животных, их клонами.

Под клоном понимают генетически однородных потомков одной исходной особи, образующихся в результате бесполого размножения.

Многочисленные потомки исходной особи имеют идентичный генотип. Однако, нужно иметь в виду, что животные, полученные в результате кло- нирования, не могут образовывать чистые линии, в которых, как известно, отсутствует генетическая изменчивость, и селекция не дает эффекта. Кло- ны животных отличаются от чистых линий в первую очередь тем, что при одинаковой в обоих случаях фенотипической однородности в чистых ли- ниях все ее гены гомозиготны, тогда как в клонах они в сильной степени гетерозиготны.

Для создания генетических копий сельскохозяйственных животных на базе клеточной инженерии разрабатываются методы клонирования: пере-

садка ядер соматических клеток в энуклеированную яйцеклетку; индуци- рование партеногенеза, позволяющего полностью передавать потомкам генотип одного из родителей. Наиболее перспективно клонирование се- льскохозяйственных животных путем трансплантации извлеченных из со- матических клеток ядер в энуклеированные яйцеклетки. Любая диффе- ренцированная соматическая клетка содержит полный набор генов, свой- ственных данному животному. Установлено, что карпиотип дифференци- рованных клеток не отличается от кариотипа оплодотворенной яйцеклет- ки – зиготы, из которой они произошли.

Урастений соматическая клетка после дифференцирования, в резуль- тате которого между клетками возникают морфофизиологические разли- чия, подобно половым клеткам, способна развиваться во взрослый орга- низм, то есть, является тотипотентной. Тотипотентная клетка содержит всю генетическую информацию, необходимую для полного развития ор- ганизма.

Уживотных соматические клетки после стадий морулы или бластулы не проявляют свойств тотипотентности. В процессе морфогенеза сомати- ческие клетки дифференцируются, то есть происходит дифференциальная

67

транскрипция генома в разных клеточных системах. В результате диффе- ренцированная клетка теряет тотипотентные свойства, что связано не с утерей генов или генома, а с глубокой и стабильной репрессией или инак- тивацией части генома. Механизм этого процесса полностью не изучен,

поэтому ограничивается использование ядер дифференцированных клеток в клонировании животных.

Впервые эксперименты по изучению генетических потенций ядер со- матических клеток были проведены в начале 20 века на тритонах. При наложении лигатуры (тонкого волоса) на оплодотворенное яйцо его ядро переходило в одну половинку цитоплазмы. При этом начала дробиться та часть яйца, где находилось ядро. Однако, если ослаблением лигатуры на- править ядро бластомера – 16 - клеточного зародыша - в безъядерную часть яйца, то и в этой половине начинается дробление. Следовательно, каждая половина зиготы формировала нормальный 16-клеточный заро- дыш. Этим было доказано, что ядро 16-бластомерного зародыша тотипо- тентно.

В 1952 г. американские исследователи Р.Бриггс и Т.Кинг, разработав новую технику пересадки, осуществили трансплантацию ядер соматиче- ских клеток зародышей в энуклеированные яйцеклетки лягушек. Суть про- водимых экспериментов сводилась к тому, что с помощью микропипеток из яйцеклеток шпорцевой лягушки удаляли ядра, а вместо них пересажи- вали ядра из клеток эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Было продемонстрировано, что ядра ранних эмбрионов в стадиях поздней бластулы и даже ранней гаструлы обладают тотипотентными свойствами, обеспечивающими нормальное развитие эмбрионов, а в дальнейшем и взрослых лягушек. В то же время при пересадке ядер из более дифферен- цированных соматических клеток поздней гаструлы нормального разви- тия эмбрионов не наблюдалось.

Дж. Гердон, усовершенствовав технику клонирования, впервые полу- чил генетически идентичных половозрелых позвоночных животных. Так, ядра из клеток эпителия кишечника головастика, пересаженные в энук- леированные яйцеклетки шпорцевой лягушки, вызывали развитие генети- ческих копий эмбрионов и взрослых лягушек. Трансплантация ядер из сильнодифференцированных клеток кожи лягушек привела в 5% случаев к получению генетических клонов головастиков. Однако, использование ядер соматических клеток взрослых лягушек не привело к развитию кло- нов до взрослых особей. Можно заключить, что ядра из клеток взрослых

68

животных и даже поздних эмбрионов по неясным пока причинам утрачи- вают свои потенции.

Внашей стране разработана технология клонирования костных рыб, позволяющая получать генетические копии. По этой технологии зароды- шевую часть эмбриона, находящегося на стадии бластулы, отделяют от тро- фической части – желтка, затем ядро клетки зародыша инъецируют мик- ропипеткой в цитоплазму неоплодотворенного яйца реципиента, кото-рое начинает дробиться и развивается в личинку.

Клонирование млекопитающих путем трансплантации диплоидных ядер в энуклеированную яйцеклетку представляет более сложную задачу. Небольшой объем зиготы млекопитающих ограничивает количество вво- димого ядерного материала и увеличивает ее повреждаемость при транс- плантации чужеродногоядра.

В1977 г. исследователи усовершенствовали методику клонирования и впервые получили живых мышей. Они удаляли из оплодотворенных яй- цеклеток один из пронуклеусов, а затем инкубировали энуклеированные яйцеклетки с цитохалазином В, который вызывал диплоидизацию остав- шегося в яйцеклетке пронуклеуса. По генетическим маркерам было уста- новлено, что одна часть эмбрионов сформировалась путем гиногенеза (при диплоидизации женского пронуклеуса), а другая – путем андрогенеза (при диплоидизациимужскогопронуклеуса).

Вначале 80-х годов был предложен новый метод слияния клеточных фрагментов с целью пересадки ядер в зиготы мыши. Он состоял из ком-

бинации двух методов – микрохирургического удаления пронуклеусов из

оплодотворенной яйцеклетки и введения чужеродных пронуклеусов или ядер 2-80 клеточных зародышей после их кратковременного культивиро-

вания с инактивированным вирусом Сендай.

В животноводстве перспективным методом клонирования является пе- ресадка ядер клеток генетически ценных самок в энуклеированные яйце- клетки малоценных животных.

Первые эксперименты по клонированию овец были проведены в 1986 г. Общая схема клонирования овец на основе пересадки ядра эмбрионов в энуклеированную яйцеклеткувключает следующие этапы:

-извлечение бластомеров из 8-16 клеточного эмбриона;

-разделение яйцеклетки – реципиентана ядросодержащий и безъядерный фрагменты;

69

-слияние безъядерного фрагмента яйцеклетки с извлеченным бластомером – донором с помощью вируса Сендай или электрического поля;

-помещение реконструированной зиготы в агаровый цилиндр;

-культивирование эмбрионов в лигатированных яйцеводах овцы – посредника до стадии бластоцисты;

-пересадка бластоцисты конечному реципиенту.

Как показали результатыэкспериментов, развитие реконструированных эмбрионов в 40% случаев проходило до стадии бластоцисты. Всего было получено после пересадки бластоцист реципиентам три живых генетиче- ски идентичных ягненка.

В 1987 г. была проведена пересадка ядер у крупного рогатого скота. В этом опыте пронуклеусы зиготы – реципиента заменяли на пронуклеусы зиготы – донора. Пересадка пронуклеусов в энуклеированную яйцеклетку

реципиента осуществлялась с помощью диэлектрофоретического слияния клеток. Реконструированные зиготы упаковывают в агар и вводят в лига- тированный (перевязанный) яйцевод овцы, где продолжается их развитие. Эмбрионы, достигшие в своем развитии стадии нормальной бластоцисты были извлечены из яйцепровода овцы и пересажены нехирургическим ме- тодом 2 коровам - реципиентам, стельность которых закончилась рожде- нием двух здоровых телят.

Реконструированные зиготы крупного рогатого скота можно культи- вировать in vitro до 8,-16,-32 – клеточной стадии. Таких эмбрионов можно не только трансплантировать коровам – реципиентам или криоконсерви- ровать, но и использовать для последующего клонирования. Таким обра- зом, можно в условиях in vitro получать неограниченное количество эм- брионов, исключая при этом процедуру извлечения эмбрионов от высоко- ценных коров.

Клонирование крупного рогатого скота на основании трансплантации диплоидных ядер соматических клеток в энуклеированную зиготу, несмот- ря на большую сложность, остается актуальным и перспективным на- правлением биотехнологии. Оно открывает возможность клонирования животных с ценными генотипами и создания на этой основе высокопро- дуктивных линий и популяций животных ускоренными темпами. Нема- ловажное значение имеет и то обстоятельство, что отпадает необходи- мость проверки эмбрионов по полу, так как трансплантация диплоидного ядра из соматической клетки в яйцеклетку автоматически связана с регу- ляциейпола.

70