Биотехнология в животноводстве

три структурных гена, состоящих из 6000 нуклеотидных пар и имеющих условные обозначения z, у и а. Каждый из них кодирует синтез соответст-

вующего фермента. Заканчивается оперон терминатором – небольшим участком ДНК, который служит стоп-сигналом синтеза м- РНК на данном опероне.

Акцепторные гены служат местом прикрепления различных белков, регулирующих работу структурных генов. Если лактоза, проникая в клет- ку (ее в данном случае называют индуктором), блокирует белки, кодируе- мые геном-регулятором, то они теряют способность присоединяться к ге- ну-оператору. Ген-оператор переходит в активное состояние и включает в работуструктурные гены.

РНК-полимераза с помощью Сар-белка (белка-активатора) присоеди- няется к промотору и, продвигаясь по оперону, синтезирует про-м-РНК. При транскрипции м-РНК считывает генетическую информацию со всех структурных генов в одном опероне. При трансляции на рибосоме проис- ходит синтез нескольких разных полипептидных цепей, в соответствии с содержащимися в м-РНК кодонами – последовательностями нуклеотидов, обеспечивающих инициацию и терминацию трансляции каждой цепи.

Тип регуляции работы генов, рассмотренной на примере лактозного оперона, называется негативной индукцией синтеза белка.

Другим типом регуляции работы генов служит негативная репрес-

сия, изученная у E.coli на примере оперона, контролирующего синтез аминокислоты триптофона. Этот оперон состоит из 6700 пар нуклео- тидов и содержит 5 структурных генов, ген оператор и два промотора. Ген

регулятор обеспечивает постоянный синтез регуляторного белка, который не влияет на работу trp – оперона. При избытке в клетке триптофана последний соединяется с регуляторным белком и изменяет его таким образом, что он связывается с опероном и репрессирует синтез соответствующей м-РНК.

Известна также и так называемая позитивная индукция, когда белковый продукт гена – регулятора активирует работу оперона, т.е. является не репрессором, а активатором. Деление это условно, и строение акцепторной части оперона, действие гена – регулятора у прокариот весь- ма разнообразны.

Числоструктурных генов в опероне у прокариот колеблется от одного до двенадцати; оперон может иметь либо один, либо два промотора и тер- минатора. Все структурные гены, локализованные в одном опероне, как правило, контролируют систему ферментов, обеспечивающих одну цепь

21

биохимических реакций. Несомненно, что в клетке существуют системы, согласующиерегуляцию работы нескольких оперонов.

К первой части акцептора гена – оператора присоединяются белки, ак- тивирующие синтез м-РНК, а к концу его – белки – репрессоры, подав- ляющие синтез м-РНК. Один ген регулируется одним из нескольких бел- ков, каждый из которых прикрепляется к соответствующей точке акцеп- тора. Разные же гены могут иметь общие регуляторы и одинаковые опера- торные участки. Гены – регуляторы действуют не одновременно. Сначала один включает сразу одну группу генов, затем через некоторое время дру- гой – другую группу, т.е. регуляция активности генов происходит «каска- дами», причем белок синтезированный в одной стадии, может быть регу- лятором синтеза белков следующей стадии.

Проблема регуляции активности генов у высших организмов имеет большое практическое значение и в животноводстве, и в медицине, т.к.

разрешение ее откроет пути сознательного управления индивидуальным развитием животных и повышением их продуктивности. В кормлении это вопрос о незаменимых, т.е. не синтезируемых организмом животного, аминокислотах и необходимости учета их при составлении рационов, т.к. недостаток незаменимых аминокислот в кормах ведет к снижению энер- гии роста, обусловленному нарушением белкового синтеза в клетке. При воспроизводстве стад, в частности в овцеводстве, используется сыворотка крови жеребых кобыл, влияющая на повышение их плодовитости, что связанос гормональной регуляцией белковогосинтеза.

Активная работа структурных генов у эукариот зависит от того, какую функцию выполняет клетка в соответствующей ткани или органе. Значи- тельная часть генов в ядрах дифференцированных клеток находится в ре- прессированном состоянии, при этом большое значение имеет тормозя-

щее действие гистонов и негистоновых хромосомных белков на синтез ДНК – зависимой РНК. Сильно сконденсированный хроматин (гетерохроматин) генетически малоактивен.

Условно структурные гены эукариот могут быть по их активности подразделены на несколькотипов. К 1-му типумогут быть отнесены гены, функционирующие во всех клетках организма. Это гены, кодирующие ферменты энергетического обмена, ферменты, необходимые для синтеза аминокислот, а также гены, контролирующие образование мембранных и других структурных белков. Ко 2-му типу можно отнести гены, функцио- нирующие в клетках тканей одного типа, например, гены, контролирую- щие синтез миозина в мышечных клетках, коллагена – в костях и т.д. К 3-

22

му типу могут быть отнесены гены специализированных клеток, выпол- няющие важные, но узкие функции – синтез глобина в эритроцитах, гор- монов в эндокринных железах и т.д.

О работе генов обычно судят по типам м-РНК, находящихся в цито- плазме. В одной клетке животных содержится от 10 до 20 тыс. разных м- РНК, но большая часть из них представлена небольшим (порядка 10) чис- лом копий, что свидетельствует о слабой работе генов, их синтезирую- щих. И только около 10% типов м-РНК, т.е. около 1-2 тыс. имеют от 1 тыс. до 150 тыс. копий, что свидетельствует об активной работе соответст- вующих генов. Число типов м-РНК и их копий зависит от функции клет- ки. Наибольшее разнообразие м-РНК содержится в клетках мозга.

У высших организмов в отличие от низших не наблюдается непосред- ственное подавление синтеза белков продуктами этого синтеза, а также непосредственной реакции на поступление в организм тех или иных ве- ществ. По сравнению с микроорганизмами у высших организмов несрав- неннобольшее значениеприобрела «каскадная» регуляция.

В отличие от м-РНК бактерий м-РНК клеток животных высоко ста-

бильна и может служить матрицей белкового синтеза длительное время или сохраняется в виде информосом в соединении с гистонами, образуя в клетке «запасный фонд» м-РНК. Так, например, у животных ряд типов м- РНК синтезируется в оогенезе, сохраняется в яйцеклетке и начинает функционировать на рибосомах после оплодотворения, оказывая значи- тельное влияние наэмбриональное развитие.

Например, длительность жизни ретикулоцитов до превращения их в эритроциты достигает 6 суток, и хотя ядра у них отсутствуют, синтез ге- моглобина идет на матрицах м-РНК, образовавшихся на предшествующей стадии нормобласта. Следовательно, у высших организмов возможны об- разование безъядерных клеток и жизнедеятельность их за счет «запасного фонда» м-РНК. В других случаях в клетках может сохраняться в неактив- ном состоянии ядро, т.е. без протекающего в нем синтеза м-РНК, как, на- пример, в эритроцитах птиц или сперматозоидах, процессы жизнедея- тельности в которых осуществляются также за счет ранее синтезирован- ной м-РНК.

Гормональная регуляция белкового синтеза. Роль гормонов в регу-

ляции синтеза м-РНК установлена у животных ряда видов. Так, у двукры- лых насекомых выделен гормон развития. Введение его личинкам спо- собствует быстрому их превращению в куколки, причем значительно ус- коряется образование и смена пуффов – мест синтеза м-РНК. Установлено

23

также, что при добавлении в среду гормона щитовидной железы, совер- шается быстрый метаморфоз - превращение головастиков в лягушек, что свидетельствует об активации генов, влияющих на процессы метаморфо- за.

Исследования развития эмбрионов у высших животных показали, что железы внутренней секреции начинают функционировать очень рано, вы-

деляемые же ими гормоны вносят существенные изменения в процессы дифференцировки и развития тканей и органов. Деятельность желез внут- ренней секреции сказывается на активации белкового синтеза и во взрос- лом состоянии. Наступление стельности, например, интенсифицирует син- тез РНК в вымени нетелей, что, несомненно, связано с гормональной дея- тельностью желез внутренней секреции, в частности половых.

Гормоны выступают в ряде случаев как индукторы и супрессоры син- теза м-РНК по типу схемы Жакоба и Моно или посредством изменения проницаемости клеточной мембраны, вследствие чего в клетку поступают вещества – индукторы синтеза м-РНК и белков. Некоторые гормоны, на- пример тироксин, влияют на усиление активности генов путем активации энергетической базы клетки и увеличения выхода АТФ и других энерго- производящих веществ, необходимых для белкового синтеза. Наконец, гормоны могут соединяться с молекулами ферментов и изменять их ак- тивность, что ведет к изменению концентрации продуктов ферментатив- ных реакций, в свою очередь подавляющих или усиливающих активность генов.

Примером действия гормона, как регулятора активности генов, может служить наиболее изученный в этом отношении гормон поджелудочной железы инсулин, «мишенью» для которого является ДНК клеток печени. В печени протекают два противоположных

процесса – гликолиз и синтез гликогена из глюкозы, уменьшающий содержание последней в крови, и глюконеогенез - синтез глюкозы из неуглеводистых веществ, увеличивающий ее содержание в крови. Оптималь-

ная концентрация глюкозы в крови поддерживается соотношением фер- ментов этих двух систем. Вебер установил, что инсулин влияет на гены, синтезирующие ферменты гликолиза и глюконеогенеза. Он активирует 3 гена, составляющие один оперон, с помощью которого образуются фер- менты, использующие глюкозу (гликолиз и синтез гликогена), и в то же время является репрессором для состоящего из четырех генов оперона, влияющего на глюконеогенез. Конечные же продукты на активность фер- ментов не влияют.

24

Гормон роста, секретируемый гипофизом, активирует синтез белков через активацию синтеза м-РНК во многих клетках организма. При гипо- физэктомии у белых крыс, согласно опытам Кернера, синтез белков по сравнению с контролем сокращается вдвое, причем резко уменьшается количество полисом. Последнее является показателем уменьшения коли- чества молекул м-РНК, т.е. гормон роста активирует ее синтез на струк- турных генах ДНК. При введении гормона роста гипофизэктомирован- ным крысам синтез м-РНК и белков возвращается к норме.

Помимо гормонов, выделяемых железами внутренней секреции, су- ществуют и другие гуморальные факторы, влияющие на активность гене- тического аппарата определенных клеток. Таков, например, белок, необ- ходимый для нормального развития симпатического отдела нервной сис- темы, представляющий собой ростовой фактор, к которому очень чувст- вительны симпатические ганглии. Он выделяется тубулярным отделом слюнных желез животных, связан с мужским половым гормоном и акти- вирует синтез м-РНК и белка строго избирательно - только в симпатиче- ском нейроне, вызывая рост этих клеток, т.е. является индуктором, акти- вирующим определенные гены потипумодели Жокоба и Моно.

К новым механизмам регуляции белкового синтеза относится и синтез дополнительной ДНК, поступающей затем в цитоплазму, где она активно синтезирует м-РНК для тех белков, которые необходимы для выполнения клеткой ее функций в организме. Настроенность ядра на синтез опреде- ленных РНК зависит от цитоплазмы, что было установлено в опытах пе- ресадки ядер, образования пуффов под воздействием разных факторов;

однако качественный состав синтезируемого белка определяется только геном, на котором синтезируется м-РНК.

При трансляции, т.е. синтезе белка на м-РНК, при недостатке в клетке аминокислот наблюдается подавление деятельности матричной РНК, т.к. свободные от аминокислот т-РНК, присоединяясь к соответствующим кодонам м-РНК, прерывают синтез белковой молекулы. Следовательно, для нормального течения белкового синтеза требуются не только м-РНК, нои достаточный запас необходимых для негоаминокислот.

У высших организмов в эмбриональный период влияние среды отно- сительноневелико. Так, температурные колебания в обычных для данного вида пределах не влияют на деятельность ядра, и только шок, вызванный резким повышением температуры, приводит к ряду нарушений вплоть до полного его выключения, или, наоборот, активизирует деление, как при искусственномпартеногенезе.

25

В постэмбриональный период организм находится под значительным влиянием среды. Оно в большей или меньшей степени отражается на его жизнедеятельности и синтезе ферментов и других белков. При задержке роста молодых крыс в результате их недостаточного питания у них изме- няется соотношение в крови белков, сохраняющиеся на уровне, характер- ном для более молодых животных. Интенсивность белкового синтеза снижается и при недостаточном кормлении коров, приводящим к паде- нию их молочной продуктивности. Все эти примеры указывают на значе- ние состояния цитоплазмы в регуляции деятельности ДНК.

Вопрос о регуляторах белкового синтеза важен не только для теории. Он имеет непосредственное отношение к практике животноводства и рас- тениеводства. Совершенно ясно, что химическое строение, а, следователь- но, и функции белков связаны со структурной ДНК и что она определяет качественный состав белков организма. Но большое значение в процессах развития и жизни организма наряду с качеством имеет и количество син- тезируемого белка, а последнее зависит от степени активности определен- ного участка молекулы ДНК. Например, ДНК определяет химический со- став гормона роста, синтезируемого в гипофизе, а отсюда и его функции. Если такого гормона синтезируется мало, то это вызывает серьезные на- рушения в развитии организма; однако и чрезмерно интенсивный синтез гормона скажется на конституции организма.

В практике основной способ управления процессами жизнедеятельно- сти организма – изменение условий среды. Поэтому решение вопроса о влиянии на состояние плазмы условий среды и факторов, регулирующих белковый синтез, имеет очень важное значение. Выяснение его дало бы в

руки практики достаточно мощное орудие для изменения животных в процессе их развития в нужную сторону путем создания соответствую- щихусловий.

1.5.Современное представление о строении и функции гена. В пред-

ставлении Г.Менделя единицей наследственности был фактор, контроли-

рующий проявление в доминантном или рецессивном состоянии одного признака. В дальнейшемпонятия огене были развитыв работах Т.Моргана,

который показал, что ген – это локус (участок) хромосомы, занимающий в ней строго определенное положение. В современном понимании ген – это функциональная единица молекулы ДНК, контролирующая последо- вательность аминокислот в кодируемой полипептидной цепи.

Специфичность гена определяется числом нуклеотидов и их уникаль- ной последовательностью. Ген имеет определенную величину, выражен-

26

ную числом нуклеотидов и молекулярной массой. Ген, кодирующий син- тез полипептидной цепи, называется структурным. Он является составной частью оперона, имеет сложную систему регуляции, осуществляемой ак- цепторными генами. Любое изменение порядка чередования нуклеотидов

–выпадение, добавление или замена хотя бы одного нуклеотида – инакти- вируетструктурный ген илиизменяет егофункцию.

Для структурных генов эукариот характерно мозаичное строение: уча- стки молекулы ДНК, кодирующие аминокислоты в полипептидной цепи, - экзоны чередуются с участками, которые не обладают этой способностью

–интронами.

Акцепторные гены каждого оперона обладают высокой специфично- стью – к ним могут присоединяться только определенные молекулы бел- ка, в т.ч. белок-репрессор, подавляющий активность структурных генов, Сар-белок, а также ферментативные белки, обеспечивающие репликацию и транскрипцию. Доля структурных и акцепторных генов в общей

ДНК в геномах разных организмов колеблется от 98 до 15%. Остальная часть ДНК генома получила название избыточной ДНК. Особенно много избыточной ДНК содержится в геномах растений. Для избыточной ДНК характерно наличие повторов – одинаковых последовательностей нуклеотидов. У мыши 70% ДНК составляют уникальные последователь- ности нуклеотидов, а 30% - повторы; у человека – 66% уникальные после- довательности, а 34% повторы.

Повторы ДНК у эукариот могут иметь различную природу. Некото- рые структурные гены, имеющие уникальную последовательность нук- леотидов, могут быть представлены несколькими копиями. Гены, коди- рующие гистоны – основные белки, входящие в состав хромосом, в моле- куле ДНК представлены различным числом копий (в гаплоидном геноме мыши содержится 30 структурных генов, кодирующих гистон Н4) У жи- вотных имеются повторы структурных генов, кодирующих глобин, им- муноглобулин, интерферон идругие жизненно важные молекулы белка.

Среди повторов генов имеются нефункционирующие гены, которые из-за выпадения или добавления нуклеотида потеряли способность синтезировать м-РНК. Их называют псевдогенами. Особен-

но многократно в молекуле ДНК встречаются повторы структурных ге- нов, контролирующих синтез р-РНК и т-РНК. Так, в гаплоидном геноме лягушки имеется около 8000 генов т-РНК, в геноме курицы – около 100 генов р-РНК, в геноме дрозофилы их около 130. В ДНК геномов содер- жатся и другого рода повторы. Они представляют собой короткие после-

27

довательности нуклеотидов, каждый из них содержит около 300 нуклео- тидных пар.

В составе избыточной ДНК у эукариот в довольно большом количестве содержатся последовательности нуклеотидов, генетическая роль которых пока еще остается не выясненной. Они получили название сателлитной ДНК, которая представляет собой последовательности, состоящие из нескольких нуклеотидных пар. У мыши они со-

стоят из 6 пар нуклеотидов, в т.ч. 5 пар АТ и пары ЦГ. Блоки (кластеры) сателлитной ДНК преимущественно сосредоточены в гетерохроматино- вых районах хромосом, расположенных около центромеры.

Транспозоны. В течение длительного времени считалось, что положе- ние генов в хромосоме и, следовательно, в молекуле ДНК является строго фиксированным, хотя Б.Мак-Клинток еще в 1953 г. доказала, что в геноме кукурузы содержатся так называемые подвижные генетические элементы. В 1975-1977 г.г.Г.П.Георгиев обнаружил в геноме дрозофилы гены, пред- ставленные десятками копий и рассеянные по разным хромосомам. Им было установлено, что эти гены являются подвижными или “прыгающими”, т.к. могут быть локализованы у разных линий и даже у отдельных особей в разных хромосомах и в разных локусах хромосомы.

Перемещение фрагмента ДНК, содержащего ген или гены из одной хромосомы в другую, им несвойственную, называется транспозицией. Фрагменты ДНК, способные перемещаться из одной хромосомы в другую или из одного локуса в другой, называют транспозонами.

Транспозиция включает два процесса: эксцизию и инсерцию. Эксцизией называется освобождение транспозона из молекулы ДНК, в которую он был встроен, а инсерцией – процесс встраивания транспозона в новый локус ДНК.

Транспозоны условно можно разделить на несколькоклассов.

Мобильные диспергированные гены (МДГ). У дрозофилы имеется око-

ло 20 семейств таких МДГ, каждое из которых содержит от 10 до 150 ко- пий, локализация которых в геноме сильно варьирует. Характерной осо-

бенностью МДГ является одинаково ориентированные длинные концевые повторы (ДКП). ДНК МДГ содержит 5-10 тыс. нуклеотидных пар, в т.ч. 250-1500 нуклеотидных пар – это ДКП.

Образование большого числа копий МДГ происходит следующим об-

разом: на матрице ДНК в локусе МДГ – элемента синтезируется РНК,

на котором при участии фермента обратной транскриптазы образуется много копий фрагментов ДНК, соответствующих МДГ, кото-

28

рые внедряются в новые локусы ДНК генома. В ДКП МДГ – элементов

имеются сигнальные последовательности для начала и окончания транскрипции, а также усилители (энхансеры), резко увеличивающие интенсивность транскрипции. Они содержат также оперон, кодирую-

щий обратнуютранскриптазу.

Другой класс активных транспозонов (МДГ) включает последовательности ДНК, кодирующие фермент транспозазу, который отвечает за транспозицию МДГ – вырезание и встраиваниетранспозонов.

Кособому классу можно отнести пассивные транспозоны – фрагменты ДНК, которые ничего не кодируют, но многочисленные копии которых могут служить субстратом для транспозазы. К их числу могут быть отнесены и длинные обращенные повторы, а также некоторые МДГ – элементы.

Ктранспозонам относят также и другие участки генома, если они ак- тивно синтезируют РНК, а затем при участии фермента ревертазы обра- зуют многочисленные копии ДНК, которые вставляются в различные уча- стки генома (в клетке может содержаться до 100000 копий каждого транс- позона).

Транспозиция играет значительную роль в реализациинаследственной информации и может быть причиной наследственного изменения призна- ка (мутации). Многие транспозоны служат матрицами для транскрипции м-РНК, кодирующей различные ферменты, в т.ч. обратную транскрипта- зу. Внедряясь в новые локусы генетического аппарата клетки, транспозо-

ны влияют на работу окружающих генов. Иногда внедрившийся транспо- зон изменяет структуру гена вплоть до создания нового, несвойственного данномулокусу.

Транспозоны могут вызвать глубокие перестройки генома, в т.ч. деле- ции, инверсии, транслокации. Для разных генетических локусов от 10 до 90% всех спонтанных мутаций являются результатом транспозиции МДГ. В обычных условиях транспозиция происходит весьма редко, под дейст-

вием некоторых факторов наблюдаются так называемые транспозицион-

ные взрывы, когда в клетке сразу перемещается большое число транспозонов, относящихся к разным классам.

В последние годы установлено, что транспозиция и образование боль- шого числа повторов МДГ сходны с ретровирусами птиц и млекопитаю-

щих. Ретровирусами называют вирусы, у которых генетическая ин-

формация записана на РНК (РНК – содержащие вирусы). Когда такой РНК – содержащий вирус проникает в клетку, при участии фермента

29

обратной транскриптазы синтезируются ДНК – копии РНК вируса. ДНК

внедряется в различные локусы генома клетки и становится составной частью молекулы ДНК. Такую ДНК называют провирусом. В геноме мыши может содержаться несколько семейств провирусов, локализован- ных в разных локусах ДНК. На этих ДНК может синтезироваться РНК и даже могут образовываться вирусоподобные частицы, но инфекционный вирус не возникает.

Вирусы, информация о которых содержится в ДНК высших организмов, получили название эндогенных вирусов (ЭВ), а кодирующие их генетические элементы эндогенных провирусов (ЭП). Подавляющее бо-

льшинство ЭП дефектны и не могут кодировать вирионы, поэтому они не являются инфекционными для родительских клеток. Вместе с тем некото- рые ЭП следует рассматривать как генетические факторы риска, повы- шающие вероятность начала канцерогенного процесса или появления но- вого онкогенноговируса.

Контрольные вопросы: 1.Расскажите о строении и функции молекулы ДНК, РНК. 2.Как происходит репликация молекулы ДНК?

3.Как реализуется наследственная информация, записанная в молекуле ДНК?

4.Расскажите, как осуществляется биосинтез белка.

5.Чтотакоегенетический код? Приведите его основные свойства. 6.Как осуществляется регуляция активности генов?

7.Как происходит регулирование транскрипции у эукариот? 8.Каково современное представление о гене как единице наследственности?

9.Что такое транспозиция, транспозоны? На какие классы транспозоны подразделяются?

10.Какую роль играет транспозиция в реализации наследственной информации?

ГЛАВА2.ГЕНЕТИЧЕСКАЯИ КЛЕТОЧНАЯИНЖЕНЕРИЯ

Возникновение генетической инженерии связано, прежде всего, с раз- витием молекулярной биологии. В конце 60-х годов многие исследователи считали, что молекулярные механизмы фундаментальных генетических процессов – репликации, транскрипции, трансляции, а также система их регуляции в основном изучены. Схема, показывающая строго однона-

30