Биотехнология в животноводстве

правленный поток генетической информации, ДНК-РНК-белок, была на- звана основной догмой молекулярной биологии. Передача информации возможна только с нуклеиновой кислоты на нуклеиновую или на белок; с белка же на белок передача невозможна. Правда, основные положения этой схемы были в основном показаны для кишечной палочки Escherichia coli, которая является прокариотическим организмом, не имеющим ис- тинного ядра. Однако логичность и простота схемы давала возможность считать ее универсальной для всего живого, в т.ч. и для эукариотических организмов, имеющих ядро, к которым относятся: животные и человек, грибы, растения и др.

Несмотря на успехи молекулярной биологии, геном сложных орга- низмов был практически недоступен для анализа: слишком велики были

геномы эукариотических организмов и слишком сложно было проводить с ними какие-либо эксперименты. Для этого необходимо было научиться «разрезать» ДНК не в случайных, а в строго определенных местах, с точ- ностью до одного нуклеотида. Возникла и другая проблема – невозмож- ность определения последовательности нуклеотидов в ДНК. Не было вы- делено ни одного гена, не была расшифрована структура гена. Одна из причин заключается в том, что даже простейшие организмы содержат очень длинные молекулы ДНК (геном кишечной палочки составляет 4.2- 106 н.п.), а геном эукариот содержит 109 – 1011 н.п. В геноме содержится несколькодесятков тысяч генов.

Сейчас генетическая инженерия позволяет вводить в ядерный аппарат реципиента не только отдельные новые гены, не присущие данному орга- низму, но и получать новые формы организмов, путем введения целых хромосом, отдельных органелл или слияние двух клеток.

2.1.Ферменты клеточной инженерии. Ферменты генетической ин-

женерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуля- ции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять раз- личные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не сущест- вующие в природе последовательности.

ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в генети-

ческой инженерии ферментов является ДНК – полимераза 1, выделенная из E.coli или фага Т-4. Он обладает способностью удлинять цепь ДНК путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК – полимераз используется в генной инженерии для построения вто- рой комплементарной цепи: при добавлении фермента к одноцепочной ДНК – матрице в присутствии праймера (короткий однонитчатый фраг-

31

мент ДНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК) произойдет ее удвоение (репликация), за счет добавления нуклеотидов. Такое свойство используется при создании к-ДНК-библиотек, для запол- нения «бреши» в цепи ДНК (застраивания фрагментов).

Использование специфических термостабильных ДНК –полимераз, выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить ам-

плификацию-увеличение количества ДНК, числа копий гена методом по-

лимеразной цепной реакции. Из некоторых вирусов была выделена РНК –

зависимая ДНК – полимераза, названная обратной транскриптазой или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК – матрице. С помощью ревертаз можно получать к-ДНК – ДНК копии м-РНК.

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наи-

более часто для лигирования используют ДНК – лигазу фага Т-4.

Нуклеазы – это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды.

Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация м-РНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (рас- щепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бак- терии фагом).

Нуклеазы по типу их действия можно поделить на группы. Нуклеазы могут действовать только на молекулы ДНК (дезоксирибонуклазы) или РНК (рибонуклеазы), либо на молекулы и ДНК и РНК одновременно. Нуклеазы избирательно могут действовать на одноцепочную или двухце- почную молекулы ДНК, или на гибридную ДНК – РНК молекулу. Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа: на экзонуклеазы и эндонук- леазы. Экзонуклеазы гидролизуют молекулы с 5’ – или 3’ – свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК.

Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям нуклеотидов, которые называются сайтами ре-

стрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает

32

ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непо- средственной близости от него. В настоящее время из разных микроорга- низмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используют около 200. Обозначение рест- риктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бакте- рий, из которого был выделен фермент и дополнительного обозначения, т.к. из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз.

Рестриктазы делятся на 3 типа. Для получения рекомбинантных моле- кул используют рестриктазы 2 типа. Основной характеристикой таких ре- стриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции сов- падают.

Сайты рестрикции рестриктаз 2 типа представлены симметричными при повороте на 1800 последовательностями – палиндромами.

Рестриктазы 2 типа можно отнести к двум группам. Одни вносят раз- рывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие – со сдвигом, с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые концы», а во – втором – «липкие», т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки.

Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут со- единяться друг с другом с помощью ДНК – лигазы, при этом сайт рест- рикции восстанавливается. Фрагменты, имеющие «тупые» концы, могут быть соединены вне зависимости от того, какой рестриктазой они были образованы. Фрагменты с «липкими» концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, т.к. ДНК – лигаза обеспечивает беспрепятственное соединениефрагментов.

2.2.Конструирование и технология рекомбинантных ДНК. Под ре-

комбинантными ДНК понимают образованные объединением in vitro (вне организма) (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Определенные фрагмен-

ты ДНК, в т.ч. и фрагменты, содержащие гены, получают с использовани- ем рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты, как с «тупы- ми», так и с «липкими» концами. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, зависящими от того, ка- кие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование

– это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного орга-

33

низма в другой. Часто эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме:

-из организма – донора нужных генов экстрагируют нативную (чужеродную, клонируемую) ДНК; подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования) с образованием новой рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК»);

-эту конструкцию вводят в клетку – хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией;

-идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);

-получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками – хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в

клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержа- щейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помощи векторных молекул, или векторов.

Векторами называются молекулы ДНК, способные встраивать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию и трансформа-

цию (перенос в другие организмы). Таким образом, вектор позволяет осуществить введение в клетку дополнительной генетической информа-

ции. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды, мобильные элементы. По профилю исполь-

зования их можно разделить на несколько типов.

1.Векторы для клонирования используют для увеличения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор, посредст- вом репликации(плазмиды и фаги).

2.Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательных генов и их белковых продуктов, а также наработки кон- кретногобелка.

3.Векторы для трансформации. Используют для введения чужерод- ного фрагмента ДНК в геном реципиента.

Современные векторные системы часто бывают полифункциональ- ными, совмещая несколько функций в одном векторе. К векторной моле- куле предъявляются следующие основные требования:

34

-вектор должен содержать уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз, что делает возможным встроить в него фрагмент чужеродной ДНК;

-вектор должен обладать определенной емкостью и не абортировать встроенный фрагмент;

-вектор должен реплицироваться в определенных клетках;

-вектор должен содержать последовательность маркерного гена, облегчающего селекцию клеток, несущих векторную конструкцию.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устой- чивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высо-

кая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества

ферментов, биохимически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечи- вает устойчивость бактериальной клетки к последним.

Впервые плазмида в качестве вектора была использована в 1973 г. в лаборатории П.Берга. Эксперименты проводились с небольшой плазмидой E.coli, несущей ген устойчивости к антибиотику тетрациклину. Она содер- жала только один сайт рестрикции. Под действием рестриктазы Eco R 1 кольцевая плазмида превращалась в линейную молекулу с «липкими» концами. Такую ДНК плазмиды смешивали с фрагментом чужеродной для кишечной палочки ДНК (ДНК золотистого стафилококка).

С помощью ДНК – лигазы фрагмент чужеродной ДНК и плазмиды соединяли в единую рекомбинантную молекулу. Затем такую рекомби- нантную плазмиду добавляли к компетентным клеткам E.coli, плазмида входила внутрь бактериальной клетки. Клетки с рекомбинантной плазми- дой отбирались на селективной среде с тетрациклином. В настоящее вре- мя на основе природных векторов сконструированы более удобные в ис- пользовании векторы.

Фаговые векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид, широ- ко используются для клонирования, но у них есть один важный недоста- ток – небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагмен- ты в среднем не более 7-8 тыс. н.п., а последовательности эукариотиче- ских генов гораздодлиннее (в среднем 10-25 тыс. н.п.).

На основе бактериофага λ (лямда) были конструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 тыс. н.n. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на ос- нове фага λ учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть мо-

35

лекулы ДНК фага не нужна для репликации фага в E.coli. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необ- ходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клониро- вания, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужерод- ной ДНК размером около 9-21 тыс. н.п. Размножаются в бактериях только те фаги, которые содержат оба конца фаговой ДНК и вставку чужеродной ДНК.

Космиды - векторы, полученные путем объединения небольших фраг- ментов ДНК бактериофага λ и плазмид. Космиды содержат гены, обеспе- чивающие их размножение в бактерии, ген устойчивости к антибиотику тетрациклину и особый участок из фага λ под названием “кос”, который содержит все вещества, необходимые для упаковки рекомбинантной ДНК в белковую головку фага. Космида состоит из 35-40 тыс. н.п. чужеродных ДНК. С помощью этих векторов гены могут быть перенесены в бактери- альные, растительные и животные клетки.

Вирусы часто используют в качестве векторов, проникающих в жи- вотные клетки. Наиболее широко в генетической инженерии используют обезьяний онкогенный вирус ОВ-40. Он относится к мелким вирусам, его ДНК состоит из 5200 н.п. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих. Иногда вирус ОВ-40 превращается в вирион, в котором внутри белковой оболочки содержится не ДНК вируса, а ДНК клетки – хозяина. С помощью вируса ОВ-40 гены β - цепи гемоглобина мыши и кролика были перенесены в клетки обезьян, где они активнофункционировали.

2.3. Синтез и выделение генов. Впервые химический синтез гена осуществил в 1969 г. работающий в США индийский ученый Х.Г.Корана с сотрудниками. Он синтезировал ген (участок молекулы ДНК), коди- рующий синтез аланиновой т-РНК пекарских дрожжей. Этот ген состоял из 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была известна.

Вначале синтезировали мелкие фрагменты ДНК, содержащие от 4 до 13 нуклеотидных пар, затем с помощью фермента лигазы их соединили в соответствующем порядке, но данный ген был не в состоянии синтезиро- вать аланиновую т-РНК, так как не содержал акцепторной системы.

В 1976 г. в лаборатории Х.Г.Кораны был синтезирован фрагмент су- прессорной тирозиновой т-РНК длиной 126 пар нуклеотидов, промотор,

36

состоящий из 52 пар нуклеотидов, и терминатор, имеющий 21 пару нук- леотидов.

К концам молекулы ДНК были прикреплены так называемые "липкие концы", состоящие из чередования нуклеотидов ААТТ (один конец) и ТТАА (другой конец). Благодаря этому данный ген был встроен в геном фага и нормально в нем функционировал. Таким образом, была показана возможность искусственного синтеза генов. Метод позволяет синтезиро- вать относительно мелкие гены, содержащие небольшое число пар нук- леотидов.

Впервые выделить ген методом трансдукции удалось Дж.Бексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг λ при размножении в клет- ке E.Coli может захватить и встроить в свой геном полный лактозный опе- рон бактерии вместе с примыкающим кнемугеном-регулятором.

Фрагмент ДНК E.Coli встраивается в геном фага λ в строгом порядке: структурные гены, оператор, промотор и регулятор. Применением дена- турации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный опе- рон и ген-регулятор E.Coli.

К сожалению, метод оказался сугубо специфичным для данного гена и не может широко использоваться в генетической инженерии.

Ферментативный синтез. Гены, кодирующие ферменты или струк- турные белки, состоящие из тысячи и более нуклеотидных пар, рацио- нальнее создавать методом ферментативного синтеза с помощью фермен- та обратной транскриптазы (ревертазы). С помощью данного фермента с м-РНК могут быть получены точные копии ДНК (кДНК).

Ферментативный синтез может быть схематично представлен сле- дующим образом. В пробирку, содержащую физиологическую бескле- точную среду, вносят нуклеозиды всех четырех типов (А, Г, Т, Ц), фер- мент ревертазу, м-РНК, кодированную природным геном, копию которого планируется получить.

В качестве "затравки" ускоряющей реакцию, вносят небольшие уча- стки молекулы ДНК, содержащие 8-10 повторов тимина (короткие одно- цепочные олигонуклеотиды). Они будут образовывать по принципу ком- плементарности двуцепочные ДНК-РНК-фрагменты, которые будут слу- жить затравкой для начала ферментативной реакции.

На м-РНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей нить ДНК. Затем на синтезированной нити ДНК строится вторая компле- ментарная нить ДНК. В результате получают фрагмент двойной спирали ДНК-точную копию тогогена, с которого была транскрибирована м-РНК.

37

Описанным способом были синтезированы гены, кодирующие глоби- ны человека, кролика, мыши, утки, голубя, иммуноглобулин мыши, белок хрусталика глаза быка, яичный белок и др.

2.4.Генетическая инженерия на уровне хромосом и геномов. Од-

ним из разделов генетической инженерии является разработка методов по экспериментальномупереносу из одной клетки в другую целых хромосом. Метафазные хромосомы, выделенные из клетки - донора, могут внедрить- ся в клетку - реципиент путем пикноцитоза. Хромосомы, внедрившиеся в чужую клетку, распадаются на мелкие фрагменты; некоторые из них со- храняются на протяжении нескольких поколений в цитоплазме клетки - реципиента. ДНК, содержащаяся в этих фрагментах, может осуществлять синтез полипептидов.

Так, например, в клетки мыши (in vitro) была перенесена 17-я хромо- сома человека, содержащая гены, контролирующие синтез тимидинкина- зы и галактокиназы. При размножении в мышиных клетках данные гены довольностойкофункционировали.

Данный метод используется в медицине при лечении больных телас- семией - тяжелым наследственным заболеванием, обусловленным мута- цией генов, кодирующих глобиновые белки - полипептидныецепи α и β, в результате чего образуются дефектныеэритроциты.

У больного телассемией берут небольшое количество кроветворных клеток костного мозга, размножают их в культуре вне организма, затем методами генетической инженерии вводят в них полноценные гены, ко- дирующие глобин, обеспечивающий нормальное развитие эритроцитов. Такие клетки снова вводят в костный мозг того же больного, и они посте- пенно замещают мутантные патологические эритроциты.

В животноводстве большой интерес представляют методы пересадки клеточных ядер в цитоплазму другого животного - получение цибридов. Например, у мыши извлекали неоплодотворенную яйцеклетку, вводили в нее ядро соматической клетки другого животного и трансплан- тировали ее в матку самки, гормонально подготовленной к имплантации. Потомство было генетически тождественно той особи, у которой было взято ядро.

2.5.Гибридизация соматических клеток. Одной из проблем генети-

ческой инженерии является гибридизация соматических клеток. Впервые возможность гибридизации клеток, культивируемых вне организма, уста- новил в 1960 г. французский биолог Ж.Барский. Он с сотрудниками, вы- ращивая вне организма в культуре ткани клетки двух линий мышей, обна-

38

ружил в небольшом количестве третий тип клеток. Эти клетки оказались гибридными и могли размножаться in vitro. По морфологическим и биоло-

гическим признакам гибридные клетки были промежуточными между исходными родительскимиклетками.

Однако, спонтанное слияние клеток в культуре ткани происходит ред- ко, поэтому использование таких гибридных клеток для проведения био- химических игенетических экспериментов затруднено.

Было известно, что клетки, зараженные каким - нибудь вирусом, могут сливаться со здоровыми клетками и образовывать гигантские многоядер- ные клетки. Эти наблюдения использовали И.Окада в Японии и Г.Харрис в Англии для разработки техники гибридизациисоматических клеток.

Они употребляли для гибридизации парагриппозный вирус Сендай, обладающий способностью сливать клетки между собой. В результате обработки этого вируса УФЛ или алкилирующим мутагеном удается по- вредить его РНК и оставить неповрежденной белковую оболочку. Такой инактивированный вирус утрачивает свои инфекционные свойства, но сохраняет способность сливать соматические клетки. С помощью инакти-

вированного вируса Сендай удалось повысить выход гибридных клеток в несколькотысяч раз.

При внесении инактивированного вируса Сендай в смешанную куль- туру двух типов клеток в некотором количестве образуются многоядер- ные гибридные клетки - гетерокарионы, содержащие в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток. Большинство многоядерных гетерока- рионов быстро погибает, но те из них, которые содержат по одному ядру обеих исходных клеток, часто выживают и размножаются делением. По- сле митоза и деления цитоплазмы из двуядерного гетерокариона образу- ются две одноядерные клетки (синкарионы), т.е. настоящие гибридные соматические клетки. Каждая из них содержит один набор хромосом ли- нии А и один набор линии Б.

Используя вирус Сендай, удалось осуществить слияние клеток абсо- лютно разных видов организмов и тканей. Например, клетки человека мо- гут сливаться с клетками мыши, крупного рогатого скота, курицы, комара и даже с клетками растений - моркови, табака. Такие межвидовые гибрид- ные клетки оказываются жизнеспособными и часто размножаются в тече- ние длительного времени. Факт совместимости клеток разного происхож- дения оказался поразительным.

Известно, что половые клетки совмещаются только при гибридизации близких по происхождению видов и тос большим трудом.

39

Межвидовые гибриды соматических клеток используют в настоящее время для решения ряда важнейших генетических и биологических про- блем. Так, с их помощью оказалось возможным проводить генетический анализ и картирование хромосом у человека. Размножаясь делением, как обычные клетки, соматические гибриды, в силу их митотической неста- бильности, в каждом поколении постепенно теряют хромосомы одного из "родителей", происходит так называемая сегрегация хромосом.

Например, гибриды клеток человек х мышь через сто последователь- ных клеточных делений, т.е. примерно в течение трех месяцев, полностью утрачивают хромосомы человека. Если с утратой гибридной клеткой ка- кой-нибудь хромосомы человека перестает вырабатываться определенный фермент, это, как правило, указывает, что ген, контролирующий работу этогофермента, сцеплен с ушедшей хромосомой.

Применяя цитогенетический анализ, устанавливают, какая из 23 чело- веческих хромосом содержится в гибридной клетке. С помощью культи- вирования их на селективных средах определяют, какие гены в данной хромосоме локализованы. Этим методом в настоящее время выявлено ло- кализациюпорядка 2000 генов в хромосомах человека.

2.6.Получение аллофенных животных. Аллофенными называют хи-

мерные организмы, содержащие разные ткани, произошедшие из клеток, полученных от разных родителей.

Б.Минтц получил аллофенных мышей путем образования смешанной бластулы из клеток черных и белых мышей. В последующих опытах со- единяли бластомеры животных, различающихся по другим признакам - окраске радужной оболочки, длине ушей, хвоста и др.

Для получения аллофернных потомков у беременных мышей, имею- щих четко выраженные альтернативные признаки, извлекали эмбрионы

на стадии восьми бластомеров и с помощью фермента проназы отделяли бластомеры. Комбинируя бластомеры от двух (и более) эмбрионов, созда- ли в специальной питательной среде единый комплексный эмбрион, кото- рый ввели в матку мыши, гормонально подготовленной к имплантации зародыша. Рождавшиеся мышата представляли собой мозаиков, у них проявлялисьпризнаки всех родительских форм.

Методика, разработанная на мышах, в последние годы используется для получения аллофенных овец.

40