Биотехнология в животноводстве

используют лабораторных животных (кроликов, мышей и др.). Метод ос-

нован на высокой толерантности слизистой половых путей самки в период течки и охоты к чужеродным белкам. Сконструирована специальная ка- мера для хранения эмбрионов в брюшной полости реципиента. В такой камере эмбрионы сохраняются в течение 72 часов.

При хранении замороженных эмбрионов (–196 0) имеется ряд пре- имуществ, которые позволяют проводить пересадку в любое время, созда- вать «банк» эмбрионов от высокоценных племенных животных, генофонд малочисленных и исчезающих пород, транспортировать эмбрионы в лю- бое время года, в любую страну.

Для замораживания эмбрионов используют автоматические про- граммные замораживатели УОП-12. Чтобы уберечь эмбрионы от разру- шения при замораживании и оттаивании, применяют специальные крио- защитные вещества, легко проникающие в клетку, - криопротектор - гли- церин. Среды готовят на фосфатно-солевом буфере, содержащем 20% сы- воротки крови и 100 тыс. ед. пенициллина. Перед замораживанием эм- брионы помещают в криопротектор с возрастающей концентрацией ве- ществ для уравновешивания осмотического давления. Затем их переносят в стеклянные пробирки, стеклянные ампулы или пластиковые соломинки. Емкости с эмбрионами маркируют.

Существует быстрый способ криоконсервации. Емкости с эмбриона- ми помещают в гнезда замораживающей камеры. Режим замораживания включает несколько этапов: охлаждение от +20 0 С до –6 0С со скоростью 1 0С/мин, искусственную кристаллизацию; последующее охлаждение до – 35 0 С со скоростью 0.3 0 С/мин; перенос эмбриона в жидкий азот.

Кристаллизация происходит в период, когда температура снижается с –5 0С до –7 0 С, при использовании глицерина в соответствующей концен-

трации (1.0-1.4М).

Размораживают эмбрионы при 25 или 37 0С в течение 10-12 с в водя- ной бане. Затем их переносят на часовое стекло и предварительно оцени- вают. Окончательную оценку проводят после отмывания эмбриона от кри- опротектора. Выживаемость эмбрионов должна быть не ниже 80%, стель- ность 55-60%, в этом случае трансплантация зоотехнически и экономиче- ски рентабельна.

3.6. Влияние трансплантации эмбрионов на генетический прогресс популяции. Создание банков глубокозамороженной спермы и разработка

методов искусственного осеменения позволили существенно увеличить интенсивность отбора быков и повысить точность оценки их племенной

51

ценности. На базе интенсивного использования генетически ценных бы- ков – производителей с применением искусственного осеменения коров глубокозамороженной спермой темпы селекции в популяции по сравне- нию с обычными увеличиваются в 2-3 раза.

В то же время генетический вклад матерей быков в прогресс селекции почти в два раза ниже вклада отцов быков. Это объясняется низкой интен-

сивностью селекции матерей быков и ненадежной оценкой их племенной ценности из-за получения небольшогочисла потомков. Эти ограничения и призвана частично снять трансплантация эмбрионов. В настоящее время при использовании трансплантации эмбрионов от одной генетически цен- ной коровы можно получать двадцать телят, используя малоценных реци- пиентов.

Однако, нередко возникает вопрос о влиянии реципиента на эмбрио- нальное и постэмбриональное развитие трансплантата. Прямое генетиче- ское влияние на эмбрион реципиент не оказывает, так как пересаженная зигота представляет сформированный генотип, состоящий из гаплоидных наборов хромосом истинных родителей. Отсутствие прямого генетическо- го влияния реципиента на эмбрион подтверждают межпородные и меж- видовые пересадки зигот, а также иммуногенетические исследования.

Вто же время могут быть вызваны модификации трансплантата, то есть ненаследственные изменения признаков, обусловленные влиянием организма реципиента во время стельности. В отличие от мутаций моди- фикациипонаследствуне передаются.

Встранах с развитым молочным животноводством для повышения генетического прогресса проводится интенсивный отбор коров – потенци- альных матерей быков. Таких коров высокой племенной ценности ис- пользуют в качестве доноров генетически ценных эмбрионов. В США и Канаде более 50% племенных быков голштинской породы были получе- ны в результате трансплантации эмбрионов. Теоретически обосновано, что если даже от каждой отобранной коровы получать до 5 телят в год, то генетический эффект улучшения больших популяций высокопродуктив- ного молочного скота достигает 47%.

Таким образом, трансплантация эмбрионов может ускорить получе- ние выдающихся в генетическом отношении быков – улучшателей при совершенствовании существующих и создании новых популяций. Интен- сивное использование коров – рекордисток в качестве доноров позволяет не только получать племенных быков, но и создавать в короткие сроки высокопродуктивные семейства.

52

Контрольные вопросы и задания:

1.Назовите основные этапы технологии трансплантации эмбрионов.

2.В каких целях применяется трансплантация эмбрионов? 3.Какие требования предъявляют к донорам при их отборе? 4.Какие существуют методы оценки качества эмбрионов?

5.Какие существуют способы извлечения оплодотворенных яйцеклеток от коров-доноров?

6.Какие существуют способыпересадки эмбрионовреципиентам?

7.Назовитеспособы хранения эмбрионов.

8.Как влияет трансплантация эмбрионов на генетический прогресс популяции?

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХЖИВОТНЫХ

4.1. Перенос генов. Для выведения улучшенных пород домашних жи- вотных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т.д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве произ- водителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получить более или менее чистые линии высокопродук- тивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее ис- ключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических ос- нов выведения новых пород домашнегоскота могут быть к ней сведены.

Однако, после того как эффективная генетическая линия получена,

вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным» геном может нести также в «вред- ные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивны- ми. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разрабо- тать абсолютно новую стратегию.

Успешные эксперименты по введению чужеродных генов в клетки млекопитающих и возможность создания генетически идентичных жи- вотных путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с уда- ленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили включить в хро-

мосомную ДНК высших животных отдельные функциональные гены или целые их кластеры.

Используемая стратегия состоит в следующем:

53

-клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки; -оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона

млекопитающих в иных условиях невозможно);

-отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;

-скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Такой подход имеет многопрактических приложений. Например, если продукт вводимого гена стимулирует рост, то трансфицированные живот- ные будут расти быстрее при меньшем количестве пищи. Повышение эф- фективности усвоения пищи всего на несколько процентов может сущест-

венно снизить стоимость конечного продукта (говядины, свинины и т.д.). Идея генетического изменения животных путем введения генов в оп-

лодотворенные яйцеклетки была реализована на практике в 1980-х г.г.

Животное, чей генотип был изменен путем введения чужеродной (экзогенной) ДНК, было названо трансгенным, вводимая ДНК – трансгеном, а весь процесс – трансгенной технологией, или трансгенозом.

Эксперименты по генетической модификации многоклеточных орга- низмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее, трансгеноз позволяет изучать болезни человека, и он применяется для генетической модификации клеток молочных желез животных с це- лью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже пред- ложен новый термин «фарминг», относящийся к процессу получения из трансгенных домашних животных белков человека или фармацевтиче- ских препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно

образуется в организме животного в большом количестве и его можно получать помере надобности без вреда для животного.

Для переноса генов млекопитающих используют три метода:

-микроинъекцию рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы;

-использование ретровирусов в качестве векторов;

-инъекцию трансформированных эмбриональных столовых кле-

ток в эмбрион.

Все методы переноса генетической информации млекопитающих ох- ватывают ранние этапы онтогенеза – от оплодотворенной яйцеклетки до формирования бластоцисты, способной имплантироваться в матку реци- пиента.

54

Перенос генов методов микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы –

основной метод получения трансгенных животных. Задачупереноса генов лабораторным млекопитающим (мышам) впервые удалось разрешить Дж.Гердону в 1980 году. Было доказано, что при инъекции чужеродных генов в мужской пронуклеус зиготы они интегрируются в хромосоме ре- ципиента, а затем в ходе развития эмбриона и новорожденного животного распределяются посоматическим и половым клеткам.

Суть метода заключается в следующем. Из яйцевода самки извлекают зиготы, освобождают их от окружающих фолликулярных клеток, инкуби- руют в специальных средах под объективом микроскопа. Зиготу фикси- руют микропипеткой, закрепленной на микроманипуляторе. С противо- положной стороны подводят инъекционную микропипетку, в которой на- ходится раствор с геном (буферная среда).

Для инъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы ис- пользуют плазмиды с конструкциями, включающими промотор и струк- турный ген. В мужской пронуклеус инъецируют около 1 пиколитра бу- ферного раствора с рекомбинантной ДНК, содержащей до 100 и более копий гена. (Промотор – участок гена, ответственный за начало его транс- крипции; пиколитр - 10 –12 л.). Как правило, 60-80% реконструированных зигот хорошо переносят микроманипуляции. После оценки жизнеспособ- ности зиготы трансплантируют самке-реципиенту другой генетической линии.

Для подтверждения интеграции чужеродного гена от мышат, родив- шихся из реконструированных зигот, извлекают кусочек ткани из хвоста или печени. ДНК из ткани этих органов анализируют с помощью дот- и блот – гибридизации. В большинстве экспериментов выход трансгенных мышей составляет 1%, однако, экспрессия чужеродного гена про- исходит у 5-10% полученных трансгенныхмышей.

Технология получения трансгенных сельскохозяйственных животных путем микроинъекции чужеродных клонированных генов в мужской про- нуклеус зиготы включает основные стадии: гормональную подготовку до- норов-самок, выделение из яйцевода оплодотворенных яйцеклеток на ста- дии двух пронуклеусов и визуализацию пронуклеусов; микроинъекцию в мужской пронуклеус зиготы раствора ДНК; трансплантацию инъециро- ванных зигот.

На основе схемы получения трансгенных мышей разработана методи- ка получения трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности для свинейона включает следующие основные этапы:

55

1.Получение оплодотворенных яйцеклеток. Для микроинъекции чу-

жеродного гена необходимо иметь оплодотворенные яйцеклетки в стадии формирования пронуклеусов. В качестве доноров, как правило, отбирают молодых свинок. Для вызывания суперовуляции инъецируют до 1500 МЕ СЖК и через определенный интервал – до 1000 МЕ ХГ – хорионический гонадотропин.

Первый гормон стимулирует рост и развитие фолликулов, второй вы- зывает овуляцию. Через 24-36 ч доноров осеменяют. Зиготы и ранние эм- брионы извлекают через 60-63ч после индуцирования полиовуляции. Рога матки промывают фосфатным буфером Дюльбекко. Извлеченные из про-

мывной жидкости зиготы должны быть оценены по морфологическим качествам. Для выявления пронуклеусов проводят дозированное центри- фугирование, чтобыосадить гранулы, покрывающие пронуклеус.

2. Конструирование гена. Типичный ген эукариот состоит из двух ос-

новных частей: регуляторной и информативной (кодирующей или струк-

турной). С помощью методов генной инженерии удаляют всю регулятор- ную часть гена и заменяют ее регуляторным участком – промотором бак- териального гена. Такая замена приводит не только к структурным изме- нениям в эукариотическом гене, нои усиливает его функционирование.

Основой создания рекомбинантных молекул ДНК служат плазмиды, выполняющие свою основную роль в качестве генетического вектора, в который вводят структурную часть молекулы ДНК эукариотического ге- на. Таким образом, рекомбинантная ДНК состоит из двух частей – промо-

тора бактериального гена и структурной части эукариотического гена.

3. Приготовление инъекционного раствора ДНК. Инъецируемый раствор ДНК освобождают от партикулярных загрязнений, способных привести к засорению инъекционной пипетки или повреждению зиготы. Все реагенты, используемые для очистки ДНК, должны быть удалены из инъекционного раствора ДНК. Приготовленный инъекционный раствор повторно центрифугируют в течение 30 мин., чтобы полностью очистить ДНК от примесей. До момента микроинъкции инъекционный раствор ДНК хранят при температуре + 200 С.

4.Микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы. Для переноса чужеродных генов в пронуклеус зиготы сельскохозяйственных животных используют инверсионный микроскоп, два микроманипулято- ра, инъекционный сосуд, инъекционную пипетку и пипетку – держатель. Зиготу фиксируют пипеткой – держателем. Инъекционную пипетку на-

56

полняют раствором ДНК из инъекционного сосуда. С помощью направ- ляющего рычага инъекционную пипетку вводят через зону пеллюцида, плазматическую мембрану и мембрану ядра в мужской пронуклеус. Инъ- екция 1-2 пл. раствора ДНК приводит к увеличению объема мужского про- нуклеуса до 50%. Инъецированные яйцеклетки переносят в свежую пита- тельную среду, где их культивируют дотрансплантации в течение 1-2 ч.

5.Трансплантация зигот. После кратковременного культивирования инъецированные зиготы оценивают по морфологическим качествам и от- бирают. В большинстве экспериментов жизнеспособными будут 80-90% инъецированных зигот, которые можно трансплантировать в яйцевод ре- ципиентов.

6.Выявление интеграции чужеродной ДНК. Для выявления интегра-

ции генов у новорожденных животных берут образцы тканей (с кончика хвоста, кровь). Из ядросодержащих клеток образца ткани извлекают вы- сокомолекулярную геномную ДНК. После расщепления такой ДНК рест- рикционными ферментами фрагменты ДНК разделяют на горизонталь- ном электрофорезе в агарозном геле. Разделенные фрагменты ДНК пере- носят на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию радиоак- тивным зондом, имеющим гомологичные последовательности ДНК. На полученном радиоавтографе будут видны только те радиоактивные по- лосы, которые имеют гомологичные с зондом последовательности. Та- ким образом, с помощью метода блот-гибридизации можно определить, что инъецированный ген интегрировался в геном исследуемой клетки.

От спаривания гемизиготных трансгенных животных первого поколе- ния можно выделить гомозиготных трансгенных животных. Данную схе- му можно использовать для получения не только свиней, но и других ви- дов сельскохозяйственных животных.

Использование ретровирусов в качестве векторов. При переносе

чужеродных генов в оплодотворенные и соматические клетки животных в качестве векторов используют ретровирусы, способные внедряться в ге- ном эмбрионов. Ретровирусы относятся к семейству РНК – содержащих вирусов, содержат молекулы одноцепочной линейной РНК и обратную транскриптазу (ревертазу) – фермент, с помощью которого в клетке про- исходит специфический синтез ДНК на РНК.

В этом случае генетическая информация передается в обратном на- правлении, т. е. от РНК к ДНК. Обратная транскриптаза в ретровирусах

способна синтезировать по матрице РНК комплементарную в ней цепь ДНК, которая служит матрицей другой комплементарной ДНК-цепи.

57

Вследствие этого создается двухспиральная молекула ДНК, содержащая генетическую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус. Под провирусом понимает- ся форма существования генома вируса, при которой этот геном объеди- нен с генетическим материалом клетки – хозяина в единые молекулы ДНК.

Схема размножения ретровируса включает следующие основные эта-

пы:

-синтезДНК– копии навирусной РНК обратной транскриптазой; -синтез двухцепочной ДНК клеточной ДНК – полимеразой; -встраивание вирусной двухцепочной ДНК в геном клетки (интег-

рированный провирус).

После интеграции репликация провируса происходит совместно с ДНК клетки – хозяина, вследствие чегопровирус передается дочернимклеткам.

Первые эксперименты по переносу ДНК в ранние эмбрионы мыши были проведены с вирусной ДНК SV-40 в 1974 г. Инъецируемая в бласто- цисту ДНК SV-40 была обнаружена в клетках новорожденных и взрослых мышей. Однако, интеграции этой ДНК в гаметы не происходило. В после- дующих опытах в качестве вектора использовали провирусную ДНК ви- русного лейкоза Молони. При этом обнаружили интеграцию в геном про- вирусной ДНК, последовательности которых были в половых клетках и наследовались как моногенные менделевские признаки, что могло привес- ти к созданию стабильной линии.

Первые результаты по интеграции ДНК аденовируса обезьян в геном мыши были получены в России. Впоследствии для избежания инфекци- онного процесса в эмбрионе стали использовать дефектный ретровирус- ный вектор.

Инъекция трансформированных эмбриональных столовых клеток в эмбрион. Клеточные популяции, из которых образуются ткани, - это кло- ны, возникшие из эмбриональных столовых клеток или клеток – родона-

чальниц. Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться в одном или нескольких направлениях, т.е. они политотипотентны. Эм-

бриональные стволовые клетки получают из бластоцисты мыши. Такие клетки можно размножать, культивировать in vitro, создавать банки клеток с желательными генетическими свойствами. В выделенные клетки можно инъецировать генныеконструкции.

4.2. Создание разных типов трансгенных животных. Мечтой мно-

гих исследователей – селекционеров мира является разработка возможно-

58

сти не просто отбора животных с измененной хозяйственно-полезной из- менчивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направленное соз- дание желаемого типа животных. Это оставалось мечтой до тех пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия – выявление ДНК как носителя генетической информации, пока не были заложены основы рекомбинант- ной техники (открытие рестрикционных энзим, клонирования ДНК и т.д.) или генной инженерии.

В относительно короткие сроки были разработаны методы выделения из генома отдельных генов, создания эффективно функционируемых ген- ных конструкций. В последующие годы были разработаны методы введе- ния чужеродных генов в геном животных – реципиентов. Селекционеры

получили в распоряжение могучий инструмент для создания животных с совершенноновыми свойствами.

Трансгенные животные с новыми хозяйственно-полезными свой-

ствами. Одним из основных направления генной инженерии на первом этапе было изменение наследственности животных в отношении увеличе- ния скорости роста, повышения надоев и улучшения качества продукции.

Рост животного является сложным процессом, который зависит от дей- ствия генов, условий питания и факторов окружающей среды. С генетиче- ской точки зрения особенно интересны гены, кодирующие гормон роста. Еще в 40-е годы было установлено стимулирующее действие гипофизар- ного ГР на молочную продуктивность коров. Однако, ввиду высокой

стоимости препаратов гипофизарного ГР и невозможности его получения из гипофизов животных в больших количества он не нашел практического применения. К концу 70-х годов был синтезирован ГР. Было показано, что ГР микробного происхождения оказывает такое же стимулирующее дей- ствие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. При приме- нении рекомбинантногоГР (13 мг в день) увеличение удоев составляет 2331%. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позво- ляющие проводить обработку один раз в две недели и даже в месяц. Еже- дневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней, овец вызывает увеличение суточных привесов на 20-30% и сопровождается со- кращением расхода кормов на единицуприроста.

У трансгенных мышей с геном ГР была установлена повышенная ско- рость роста (четырехкратная) и удвоенная конечная живая масса, а у транс-

генных свиней с геном ГР не наблюдалось соответствующего ускорения роста (15,7-16,5%). Вместе с тем, все авторы единодушно отмечают, что

трансгенные свиньи имеют более чем двухкратное уменьшение толщины

59

шпика (18-20 мм у контрольных свиней, против 7-8 мм у трансгенных). Аналогично трансгенные овцы имели 5-7% жира по сравнению с 25-30% уконтрольных животных.

Установлено, что введение чужеродного гена ГР в популяцию линий мышей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокое ростовое плато. В популяциях свиней, наоборот, генетиче- ский потенциал роста, по-видимому, находится недалеко от потенциаль- ного плато и поэтому дополнительным введением гормона роста или пе- реносом генов гормона роста можно добиться лишь незначительного эф- фекта в скорости роста.

Более реальные перспективы улучшения качества или состава продук- тов животноводства достигают введением соответствующих генных кон- струкций в организм животного. Рассматривается, например, возможность

уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных овец или крупного рогатого скота, которые несут специфический для молочной же- лезы промотор, сцепленный с геном лактозы. При этом становится воз- можным расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу уже в молоке коров. Молоко таких животных может использоваться лю- дьми, у которых отсутствует фермент лактозы. Обсуждается также воз- можность введения генов, вырабатывающих определенные антитела, ко- торые предотвращают маститы.

Все исследователи отмечают увеличение содержания белка и умень- шение содержания жира в тканях трансгенных животных с генами гормо- на роста, что заметно повышает качество и товарную ценность получае- мых мясопродуктов.

Эти исследования дают основание предполагать, что молекулярные методы повышения продуктивности и особенно улучшения качества про-

дукции будут играть важную роль в зоотехнической науке и в развитии животноводства в целом.

Трансгенные животные с устойчивостью к заболеваниям. Потери,

вызванные заболеваемостью у сельскохозяйственных животных, состав- ляют более 10% стоимости продукции. Поэтому более важное значение приобретает селекция животных порезистентности к заболеваниям.

Резистентность – это наследственная генетически обусловленная невосприимчивость животных к определенным микроорганизмам, виру-

сам, паразитам или токсинам. К сожалению, попытки вести селекцию на устойчивость к разным заболеваниям не дали радикальных результатов, хотя известны отдельные положительные примеры. Созданы, в частности,

60