Биотехнология в животноводстве

шат составляет 3-6% от числа трансплантированных агрегационных бла- стоцист.

При создании химер сельскохозяйственных животных классический метод был несколько модифицирован. Химерные морулы или бластоци- сты сельскохозяйсвенных животных помещают в прозрачную зону и агар. При этом исходят из следующего правила. Если общее число объединяе- мых бластомеров, происходящих от разных генотипов, не превышает раз- меров обычного эмбриона, их помещают в пустую зону пеллюцида неза- висимо от вида сельскохозяйственных животных. Если агрегационный эмбрион превосходит в 3-4 раза по размерам нормальный эмбрион, его заключают в прозрачную зону от полностью развиваюшейся бластоцисты; если в 4-8 раз, то его упаковывают в заранее заготовленную полость в ага- ровомцилиндре.

Все композиции бластомеров, инъецируемые в пустую прозрачную оболочку заливают в агар и заключают в малый агаровый цилиндр, поме- щенный в агаровый цилиндр большего размера. В таком виде агаровые

цилиндры с агрегационными эмбрионами вводят в яйцевод гормонально подготовленного промежуточного реципиента, где агрегационный эмбри- он развивается до химерной бластоцисты. Химерные бластоцисты извле- кают из яйцевода животного – посредника, освобождают от остатков агара и пересаживают реципиенту.

2.Инъекционный метод. Метод более трудоемок, но с использова- нием микроманипуляционной техники и микрохирургического вмеша- тельства позволяет решать проблемы, которые неразрешимы на агрегаци- онных химерах. Он предложен Р. Гарднером.

Суть этого метода заключается в введении клеток внутренней клеточ- ной массы бластоцисты донора в бластоцель эмбриона реципиента. Бла- стоцисту удерживают всасывающей пипеткой и, используя микроманипу- ляторы, трофобласт разрезают вместе с зоной пеллюцида и растягивают двумя стеклянными иглами. В образованное в трофобласте отверстие вво- дят третью иглу и с ее помощью отверстие расширяют, придавая тре- угольную форму, через которое инъецируют внутреннюю клеточную мас- су донорского зародыша в бластоцель эмбриона реципиента. С помощью этого метода можно инъецировать не только внутреннюю клеточную мас- су (ВКМ) ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки. По- лученную химерную бластоцисту, как и при агрегационном методе, трансплантируют в матку мыши, находящейся на соответствующей ста- дии ложной беременности. Микроманипуляции проводят в капле стан-

81

дартной питательной среды под вазелиновым маслом в специальной мик- рокамере или на термостатноммикроскопе.

Инъекционный метод получения химер используют в тех случаях, ко- гда агрегационный метод на дает результатов. Например, у некоторых ви- дов животных после удаления зоны пеллюцида дальнейшего эмбриональ- ногоразвития непроисходит.

Этот метод приемлем для создания межвидовых химер, так как разная

природа наружного слоя трофобласта может служить препятствием для имплантации химерной бластоцисты в матке реципиента. Инъекционный метод получения химерных животных позволяет выяснить, когда проис-

ходит утрачивание тотипотентных свойств бластомерами развивающегося эмбрионамлекопитающих.

6.2.Маркеры химер. Ценность химер для изучения реализации гене- тической информации в процессе онтогенеза во многом определяется на- личием маркеров. У млекопитающих клетки в онтогенезе мигрируют и взаимодействуют друг с другом, что создает сложности при анализе кле- точных родословных.

Известно, что у здорового животного каждая клетка окружена клетка- ми идентичного генотипа, поэтому вопросы клеточной автономии решать очень трудно. Однако, при изучении химер можно выяснить детермини-

руется ли фенотип клетки собственным ее генотипом или же окружением соседних клеток. Поэтому метод экспериментальных химер может слу- жить инструментом для изучения экспрессии генов и генетического кон- троля клеточных взаимодействий в онтогенезе. Так, на химерах было обоснована клональная теория развития. Суть ее состоит в том, что любой специализированный тип клеток состоит из определенного числа клеточ- ных клонов, образующихся в результате размножения родоначальных кле- ток. Для идентификации химер или отдельных компонентов химеры при- меняют разнообразные маркеры.

Генетические клеточные маркеры. С помощью генетических кле-

точных маркеров можно идентифицировать клетки разного генотипа, из которых сформированы ткани химер.

В 80-е годы стали использовать эффекты мутантных генов, нарушаю- щих строение, функцию или миграцию определенных клеточных систем. Такие маркеры, локализующиеся в клетке, обладают цитоавтономностью, внутриклеточной локализацией, имеют несколько наследственно детер-

минированных вариантов и легко выявляются на гистологических срезах без сложной обработки. Наиболее соответствует предъявляемым требова-

82

ниям пигмент меланин, локализованный в волосяном покрове и клетках ретинального пигментного эпителия. Мутантный ген, вызывающий в го- мозиготном состоянии нарушение или блокаду синтеза меланина мелано- цитами, широко используется в качестве генетического маркера в экспе- риментах с химерами млекопитающих, особенно лабораторных живот- ных.

В роли генетических маркеров выступают антигены, генетическое раз- нообразие которых огромно, но их трудно выявить. С помощью иммуно- логических методов обнаружено множество антигенов. Так, у многих ви-

дов млекопитающих были идентифицированы главные антигены или главныегенетические локусыгистосовместимости.

Антигены этого главного комплекса изучены наиболее полно у мы- шей. Система гистосовместимости у мышей, названная генами Н-2, вклю- чает два локуса более чем с двадцатью аллелями 17 хромосомы. Установ- лено, что гены Н-2 комплекса экспрессируются цитоавтономно на ранних стадиях во всех клетках эмбриона мыши. Поэтому Н-2 антигены призна- ны наиболее надежными маркерами клеточных популяций ухимер.

В качестве генетических клеточных маркеров используют также хро- мосомные различия между линиями или популяциями клеток, составля- ющими ткани химер. Среди хромосомных маркеров особо выделяют раз- личные типы хромосомных транслокаций, отдельные участки хромосом, определяемые методом дифференциальной окраски, количество перицен- трическогохроматина и половые хромосомы.

Однако, хромосомные маркеры имеют недостатки. Хромосомный ана- лиз возможен только для делящихся клеток и не дает информации о про- странственном распределении клеток в тканях химер.

Биохимические маркеры. Для идентификации клеточных популяций у химер используют биохимические маркеры: гемоглобин, сывороточ-

ные белки, ферменты. Особое место отведено изоферментам (изоцитратдегидрогеназа, глюкозофосфатизомераза и фосфоглицераткиназа),

выделяемым с помощьюэлектрофореза.

Фенотипические меркеры. При создании химер сельскохозяйствен- ных животных, происходящих от фенотипически контрастных пород или видов, широко используют морфологические маркеры. Породы и особен-

но виды сельскохозяйственных животных выделяют по качественным или количественным признакам. В большинстве случаев в животноводстве по- роды классифицированы по масти, экстерьеру, направлению продуктив- ности и другим признакам. Наиболее часто у межпородных и межвидовых

83

генетических химер, полученных от контрастных форм, для идентифика- ции химер используют простые морфологические признаки, имеющие моногенную или олигогенную природу.

6.3.Межвидовые и межпородные химеры. Получение химер лабо-

раторных млекопитающих. Первыми созданными и генетически иден-

тифицированными химерами были химеры мышей линий окраски агути и черной. Химеры были крапчатыми, причем агути (кремовый цвет) и чер- ный цвет дали окрас, не встречающийся ни у одного вида мышей.

Было доказано, что химеризм может проявляться не только по всему волосяному покрову, но и в отдельных волосах. Так, у химер из пигменти-

рованной и непигментированной линий одни волосы были полностью пигментированы, другие лишены пигмента, а третьи оказались пятнисты- ми. Для шерсти химер агути ↔ не агути выявлена различная степень про- межуточной экспрессии генов, соответствующая, по-видимому, волося- нымфолликулам сразличной долейсоставляющихгенотипов.

Если химеризм затрагивает несколько локусов, влияющих на окраску шерсти, то при образовании пигмента возникают фенотипические взаимо- действия клеточных популяций. При этом синтез пигмента определяется генотипом меланоцитов, а распределение пигмента в волосе зависит от клеток волосяного фолликула.

В последние годы большое внимание уделяется получению межвидо- вых и межпородных химер млекопитающих. Это особенно важно в селек- ции сельскохозяйственных животных, так как межвидовые и межпород- ные химеры в одном организме могут сочетать разные хозяйственно важ- ные признаки.

Впервые межвидовые химеры мышей были получены инъекционным и агрегационным методами. Использовали два близких вида мышей – ла- бораторную и дикую азиатскую. Эти виды, имея сходство по размерам те- ла и продолжительности эмбрионального периода, между собой не скре- щиваются. Химеры были созданы путем инъекции внутренней клеточной массы дикой азиатской мыши в бластоцисты лабораторной мыши с по-

следующей трансплантацией химерных бластоцист в матку реципиентов лабораторной мыши. Анализ химерных эмбрионов показал отсутствие иммунологической несовместимости клеток разных видов мышей, а раз- витие межвидовых и внутривидовых химер было одинаковым.

Другой результат получен, когда проводили реципрокную инъекцию внутренней клеточной массы с пересадкой химерной бластоцисты реци- пиенту лабораторной мыши. В этом случае химерные эмбрионы погибали

84

после имплантации. Однако, у таких же межвидовых химер, полученных агрегационным методом, эмбриональное развитие проходило нормально. Следовательно, бластоцисты мыши дикого азиатского вида не развивают- ся в матке лабораторной мыши, в то же время включение в химерный трофобласт клеток с генотипом лабораторной мыши обеспечивает нор- мальное развитие агрегационных химер. Было доказано, что клетки роди-

телей обоих видов мыши принимают участие в формировании химерного трофобласта.

Получение агрегационных внутривидовых химер – мышей позволило установить, что организм химеры включает генотипически различные по- пуляции клеток, то есть, представляет мозаику. Это позволяет анализиро- вать механизм действия различных генов, особенно мутантных, в процес- се онтогенеза млекопитающих.

Установлено, что чем позже стадия развития эмбриона, от которого взята внутренняя клеточная масса для инъекции в бластоцель, тем меньше вероятность получения химер, и на основе инъекционного метода были получены новые данные для раскрытия механизма дифференцировки кле- ток.

Интересно отметить, что при инъекции в бластоцисту внутреннюю клеточную массу тератокарциномы, ее клетки в случае интеграции в эм- брион утрачивают раковые признаки. Следовательно, опухолевые клетки под влиянием нормальных эмбриональных клеток превращаются в нор- мальные. Эти данные имеют большое значение при получении химерных животных, устойчивых к опухолевым заболеваниям.

Используя метод агрегации, были получены химерные эмбрионы раз- личных видов грызунов: мыши и крысы, мыши и рыжей полевки. Такие

межвидовые агрегационные химеры грызунов нормально развивались до стадии бластоцисты, а в составе внутренней клеточной массы и трофобла- ста были выделены клетки обоих видов. Можно полагать, что химерный

трофобласт препятствует имплантации бластоцисты в матку реципиентов мыши или крысы. Так, пересаженные химерные бластоцисты в матку мы- ши или в маткукрысы погибали до имплантации или же сразупосле нее.

Химерные эмбрионы мыши и крысы были получены и методом инъ- екции. В бластоцисту мыши была инъецирована внутренняя клеточная масса крысы, и химерная бластоциста была пересажена ложно беремен- ной мыши. Из 56 трансплантированных в матку мыши химерных бласто- цист было получено 28 эмбрионов, развивающихся до 7.5 – 9.5 суточного возраста. У пяти эмбрионов в эктодерме были выявлены генотипы как

85

крысиных, так и мышиных клеток. В дальнейшем происходит селекция клеток мышиного генотипа. В тканях новорожденных химер клеток кры- синогогенотипа не обнаружено.

Электронно-микроскопический анализ клеток тканей химер мыши и крысы показал, что в химерной бластоцисте в состав внутренней клеточ- ной массы и трофобласта были включены производные клетки обоих эм- брионов. Однако, генотип мышиных клеток принимает более активное уча- стие в создании внутренней клеточной массы, чем генотип крысиных кле- ток.

Создание химер сельскохозяйственных животных. Успехи, достиг-

нутые в разработке методов создания генетических химер лабораторных млекопитающих, позволили практически подойти к получению химер сельскохозяйственных животных.

В1974 г. в Кембридже были получены генетические химеры овцы, происходящие от четырех родителей. Из трех явных химер все были сам- цами, причем два оказались с ХХ/ХV – хромосомами и один с XV/XV. Вы- ход химерных овец был очень низкий. Лишь три из 33 потомков имели признаки обеих родительских форм.

В1983 г. были получены первые межвидовые химеры овцы и козы. Известно, что овца и коза не относятся к близким видам и между собой не скрещиваются. Пересаженные эмбрионы от одного вида другому в боль- шинстве случаев погибают. Для защиты трансплантированных химерных эмбрионов от иммунологической реакции реципиента был применен ме-

тод создания трофобласта химерного эмбриона только из клеток вида ре- ципиента, а сами эмбрионы были заключеныв агар.

Для получения химер овцы и козы использовали как инъекционный, так и агрегационный методы. При агрегационном методе из четырех – или восьмиклеточных эмбрионов овцы и козы извлекали бластомеры, которые помещали в пустую зону пеллюцида или заключали в агар и культивиро- вали в лигатированных яйцеводах овцы в течение 5-6 суток. Нормально развитые химерные бластоцисты пересаживали в матку овцы или козы.

При инъекционном методе внутреннюю клеточную массу с окружаю- щими клетками трофобласта выделяли из бластоцист овцы и инъецирова- ли в бластоцисту козы или наоборот. Реконструированные бластоцисты трансплантировали соответственно в матку козы или овцы. В итоге было получено 26 потомков, восемь из которых (30.8%) оказались химерами. В результате применения агрегационного и инъекционного методов одно- компонентных животных – овец было в четыре раза больше, чем коз. Эм-

86

брионы вне зависимости от видовой принадлежности нормально прохо- дили развитие в матке самки другого вида животного. Тот факт, что из всех полученных потомков лишь 30,8% были истинными межвидовыми химерами, а остальные однокомпонентными, одного вида с реципиентом,

свидетельствует о происходящей в процессе эмбриогенеза перестройке их генотипа в сторонувида реципиента.

У большинства межвидовых химер овцы и козы выявлена мозаичность только волосяного покрова, а клетки крови соответствовали овечьим. У химерных животных шерсть – смесь волос исходных видов, рога по строению – как у козы, но закручены, как у барана, а экстерьер соответст- вовал одномуиз родительских видов.

Однаагрегационная – межвидовая химера, фенотипически похожая на козу, была получена в результате агрегатирования трех козьих эмбрионов и одного овечьего. Кровь этой химеры с шерстным покровом из козьих и овечьих волос содержала козьи и овечьи эритроциты и лимфоциты. Одна- ко к 3-месячному возрасту соотношение форменных элементов крови су- щественноизменилось в сторонупреобладания клеток овечьеготипа.

Анализ результатов исследования показывает, что у межвидовых хи-

мер овцы и козы происходит положительная селекция клеточных клонов овечьего генотипа, что отмечалось у химер крыса ↔мышь. Интересен факт рождения ягненка от козы и козленка от овцы, что не наблюдается при межвидовых пересадках эмбрионов этих видов. Полученные одно- компонентные животные развивались изинъекционных химер.

ВСША от инъекции внутренней клеточной массы бластоцисты коз в бластоцисту овец были получены овечье – козьи химеры. 22 химерные бластоцисты хирургически трансплантировали 12 овцам – реципиентам. От 9 суягных овец было получено 13 потомков. Поэлектрофоретическому анализу крови и кариотипу 2 из них отнесены к межвидовым овечье-ко- зьим химерам, 10 животных – к овце, 1 – к козе.

В1985 г. в США получены межпородные химеры овцы – между по- родами рамбулье и финский ландрас. Из 15 внутривидовых химер у пяти по признакам антигенов эритроцитов, гемоглобина и трансферринов кро- ви был подтвержден генетический химеризм.

Вначале 80-х годов были проведены эксперименты по получению химер подвидов крупного рогатого скота (европейского и зебуевидного). Применяли агрегационный метод, для которого брали раннюю морулу. Извлеченные морулы обрабатывали проназой с целью удаления прозрач-

ной оболочки. Полученный объединенный агрегат бластомеров кратко-

87

временно культивировали in vitro. Однако, химерные морулы, пересажен- ные в маткукоровам – реципиентам,погибали.

Вдальнейшем инъецировали внутреннюю клеточную массу бласто- цисты скота европейского подвида в бластоцель зебуевидного скота. В результате получили семь телят, среди которых один был идентифициро- ван как четырехродительский химерный теленок. Фенотипически он не отличался от сверстников, но при идентификации типа крови у него был выявлен эритроцитарный антиген, типичный для скота европейского под- вида. Авторы предполагают, что химеризм мог быть и у других телят, од- нако из-за отсутствия соответствующих маркеров им не удалось точно установить этот факт.

В1982 г. в Германии была проведена инъекция маркированных по хромосомам клеток бластоцист в обычную бластоцисту коровы и после-

дующая пересадка корове – реципиенту химерной зиготы, что привела к рождению химерной телочки. У четырех родителей, реципиента и химер- ной телочки были проведены цитогенетический и биохимический анали- зы. У химерной телочки по ряду признаков подтвержден генетический химеризм.

Позднее в ФРГ (1985) были получены химерные телята после агрега- ции половинок 32 – клеточных эмбрионов от коров контрастных пород – швицкой (бурой) и голштино-фризской. Из семи родившихся телят у пяти отсутствовали признаки химеризма, а у двух в фенотипе сочеталась харак- терная масть исходных пород – бурая и черно-пестрая.

В ВИЖ-е инъекционным методом был получен химерный бычок чер- но-пестрой и красной пород, который в фенотипе сочетал черно-пеструю масть с красными пятнами. Кроме этого, химерные эмбрионы были скон- струированы путем деления на части бластоцист айрширской, голштин- ской, голландской и черно-пестрой пород скота. Исходные породы были контрастными по масти. По схеме опыта красно-пеструю айрширскую корову осеменяли спермой красно-пестрого голшитинского быка, а черно- пеструюкорову – спермой голландского быка.

От каждого из двух доноров было получено по 6 эмбрионов, которые делили на две части, и затем проводили их агрегацию. Было получено 12 эмбрионов – химер от четырех пород. После трансплантации родились шесть химерных телят, в том числе один бычок. Для подтверждения хи- меризма в качестве теста использовали масть, группы крови, полимор- физм трансферрина, амилазы, гемоглобина и активность ряда ферментов. Было установлено, что один бычок и одна телочка оказались химерными

88

по масти. Остальные телочки имели химеризм по типам белков и биохи- мическим показателям. По группам крови все химеры являлись полными сибсами подвум матерям и двум отцам.

У химер чередовались черные, белые и красные пятна по корпусу. Для изучения типа наследования масти спермой химерного быка были осеме- нены 78 телок черно-пестрой породы, от которых было получено 57 по- томков. Все потомки имели красно-пеструю или черно-пеструю масть и не было ни одного потомка с трехцветной мастью. Следовательно, в гено- типе химер присутствуют гены, контролирующие либо черно-пеструю, либокрасно-пеструю масть. Вследствие этого химерный бык не передавал по наследствусвоим потомкам химеризм по масти.

Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность получения генетических химер в животноводстве. Однако, в практике жи- вотноводства химеры пока не находят применения.

Химерные животные не передают потомкам характерную для них ге- нетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным жи- вотным у потомков происходит расщепление, в результате чего наруша- ются ценные генетические комбинации. Хотя химерные животные под-

держивают хозяйственно важные признаки лишь на протяжении одного поколения, в разведении крупного рогатого скота они могут представлять большой практический интерес. Например, можно создать химерных жи- вотных, сочетающих такие признаки, как молочная и мясная продуктив- ность, которые являются антагонистами и несовместимы в одном орга- низме. Создание инъекционных химер путем введения в эмбрион опреде-

ленных линий клеток позволит улучшить иммунную систему и повысить резистентность к рядуболезней.

Метод получения экспериментальных химер представляет большой интерес для создания линий (клонов) животных путем партеногенеза. Эм- брионы млекопитающих, развивающиеся из партеногенетически активи- рованных яйцеклеток, погибают. Однако при агрегации с биологически полноценными эмбрионами клетки ранних партеногенетических зароды- шей оказывают влияние на построение тканей химерного животного. Если из партеногенетических клонов клеток будут формироваться гаметы хи- мерной особи, то ее генотип можно закрепить в следующем поколении.

Контрольные вопросы: 1.Чтоозначает термин "химера"?

2.Чтотакое первичный и вторичный химеризм?

89

3.С какой целью создают химер?

4.Какие методыполучения химер Вы знаете?

5.Какие маркеры применяют для индентификации химер или их от.дельных компонентов?

6.Расскажитео получении химер лабораторных млекопитающих. 7.Расскаж.ите о создании химер сельскохозяйственных животных.

ГЛАВА7. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОКВНЕ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНОГО

7.1.Культивирование ооцитов вне организма животного. Одним их

путей получения большого количества потомков от генетически ценных самок сельскохозяйственных животных, – оплодотворение ооцитов и куль- тивирование эмбрионов вне организма (in vitro). При традиционных мето- дах воспроизводства сельскохозяйственных животных самки продуциру- ют значительно меньшее число гамет, чем самцы. Так, общее число по- тенциальных, или незрелых, половых клеток у коровы составляет от 100 тыс. до 1 млн., причем менее 0,01% из них овулируют из зрелых фоллику- лов яичника. Если учесть, что при интенсивном ведении молочного ското- водства продолжительность продуктивной жизни коровы в среднем сос- тавляет три-четыре отела, то от каждой коровы можно получить не более четырех телят. Максимальное использование генетического фонда яйце- клеток возможно лишь в условиях созревания и оплодотворения их in vitro.

Проблема созревания и оплодотворения ооцитов in vitro с последую- щим культивированием эмбрионов, их нехирургической пересадкой ре- ципиентам и получением многочисленногопотомства окончательно не ре- шена.

Оплодотворение in vivo созревших в яичнике ооцитов, если рассмат- ривать его изолированно от созревания ооцитов in vitro, имеет ограничен- ное применение для разведения сельскохозяйственных животных. В этом

случае в результате индукции суперовуляции хирургическим путем или при убое коровы можно получить единицы созревших in vivo полноцен- ных ооцитов. Лишь сочетанием оплодотворения созревших in vitro ооци- тов с последующей трансплантацией полученных эмбрионов можно су-

щественно повысить использование генетического потенциала женских гамет.

90