Биотехнология в животноводстве

5.2. Создание партеногенетических животных. Партеногенез – форма бесполого размножения, при котором из неоплодотворенной гап- лоидной или диплоидной яйцеклетки без участия спермия развивается эм- брион. Возникшие такимобразом партеногенетические особи в своих хро- мосомах содержат толькогены матери.

В биологии размножения животных выделяют две разновидности пар-теногенеза – гиногенез и андрогенез. При гиногенезе спермий проникает в яйцеклетку, но функция его состоит лишь в активации неоплодотворенной яйцеклетки, мужской пронуклеус в самом оплодотворении не участвует. В этом случае мужской пронуклеус элиминируется из зиготы. Однако, важно знать, что при гиногенезе спермий может внести в неоплодотворенную яйцеклетку внехромосомные, в т.ч. и наследственные факторы, которые могут принимать участие в индивидуальном развитии животного.

При андрогенезе спермий активирует яйцеклетку, но слияние пронуклеусов не происходит, а женское ядро элиминируется из зиготы. Поэтому эмбрион, возникший из такой зиготы, содержит полный набор отцовских хромосом. В этом случае зигота, а затем и эмбрион развиваются с участием набора хромосом мужского ядра.

При характеристике партеногенеза различают диплоидную и гаплоид- ную формы. При диплоидной формепартеногенеза редукционноеделение полностью подавляется, в то время как эквационное деление происходит беспрепятственнои диплоидный набор хромосом восстанавливается.

Известно два механизма диплоидизации партеногенеза: амейотиче- ский и мейотический. При амейотическом партеногенезе активация ооци- тов (яйцеклеток) происходит на метафазе первого деления, когда в заро- дышевых клетках набор хромосом находится в диплоидном состоянии.

Под влиянием необычных условий или с помощью методов клеточной инженерии на этой стадии мейоза выпадает стадия редукционного деле- ния, затем сразу совершается второе – эквационное деление мейоза, разде- ляющее сестринские хроматиды. В результате формируется яйцеклетка с диплоидным женским пронуклеусом. Из таких яйцеклеток могут разви- ваться диплоидные эмбрионы исключительно женского пола. Однако, у млекопитающих, включая сельскохозяйственных животных, амейотиче- ский партеногенез неизвестен.

Подобный путь развития по типу гиногенеза у млекопитающих воз- можен на основе использования микрохирургической манипуляции. В

этом случае вместо активации ооцита к партеногенетическому развитию

71

проводят обычное оплодотворение яйцеклетки и путем микрохирургиче- ского удаления мужского пронуклеуса и последующей диплоидизации ос-

тавшегося женского пронуклеуса можно получить диплоидных женских потомков, гомозиготных по всем генам матери.

При мейотическом партеногенезе мейоз протекает нормально, то есть завершаются оба деления с формированием женского пронуклеуса. Пос- ледний делится на два гаплоидных дочерних ядра, которые объединяются в одно женское диплоидное ядро, обеспечивающее партеногенетическое развитие эмбриона, а затем и особи по материнской линии. Мейотический партеногенез представляет для селекции большой интерес, так как позво- ляет создавать полностью гомозиготные линии в течение одного поколе- ния.

Естественный, или спонтанный партеногенез распространен лишь у некоторых видов птиц, насекомых, а также у ракообразных и коловраток. В 1986 г. русским биологом А.А. Тихомировым было открыто явление искусственного партеногенеза тутового шелкопряда. Впервые он экспе- риментально доказал, что неоплодотворенная яйцеклетка тутового шел- копряда может быть активирована искусственными стимуляторами.

В 30-х годах ХХ века академик Б.Л. Астауров и его школа разработали

эффективную технологию партеногенетического размножения тутового шелкопряда. Суть этой технологии состоит в том, что неоплодотворенные яйца активируют высокой температурой (460 С) в течение 18 мин, в ре- зультате чего выпадает из мейоза стадия редукции хромосом и формиру- ется яйцеклетка с диплоидным набором хромосом. Все партеногенетиче- ские потомки представлены самками с генотипом матери, являясь ее гене- тическими копиями, или генетическим клоном. Продуцирование шелка у самок значительно ниже, чем у самцов, поэтому для селекции больший интерес представляют клоны, состоящие из самцов. В.А. Струнникову уда-

лось разработать метод оплодотворения самки двумя самцами и создать андрогенетическиеклоны.

В 70-е годы в связи с разработкой методов культивирования и созре- вания фолликулярных ооцитов in vitro начались планомерные исследова- ния по стимуляции партеногенеза у млекопитающих, включая и сельско- хозяйственных животных.

Разработка новых методов клеточной инженерии позволяет вести экс-

перименты по стимуляции яйцеклетки к партеногенетическому развитию на разных стадиях ее созревания, особенно на стадиях до прохождения первогомейотического деления созревания.

72

В настоящее время испытано много агентов, способных активировать

яйцеклетки млекопитающих к партеногенетическому развитию. В каче-

стве стимуляторов используют механические воздействия, тепловой, электрический или осмотический шок, ферменты (гиалуронидаза, трипсин, проназа), двухвалентные катионы, антисептики, особенно этанол, транквилизаторы, ингибиторы синтеза белков.

Анализ проведенных исследований показывает, что активирующие аген-

ты в основном вызывают активацию яйцеклеток к партеногенетическому развитию. Однако, партеногенетические зародыши, имеющие на первых ста- диях дробления нормальные пронуклеусы, в процессе дальнейшего эмбрио- нального развития, как правило, погибают. Причины этого не установле- ны. Из широкого спектра агентов удовлетворительные результаты (разви- тие до бластоцист) получают лишь при использовании теплового шока и этанола.

Ученые исследовали влияние на овулировавшие яйцеклетки мышей нагревания яйцеводов до t-37-420 С. Нагревание, охлаждение и повторное нагревание яйцеводов привели к активации яйцеклеток и получению пар- теногенетических зародышей при их культивировании in vitro. В культу- ральной среде партеногенетические эмбрионы развивались до стадии бла- стоцисты. Преимущество теплового шока состоит в возможности более

точного его дозирования и изучения действия на яйцеклетки дробных доз многократногонагревания или чередования нагревания и охлаждения.

Следующим агентом, действие которого на яйцеклетки млекопитаю- щих можно точнодозировать, является этанол. Он активирует яйцеклетки мыши как в материнском организме при внутрибрюшном введении, так и

при добавлении его в культуральную среду с изолированными ооцитами или яйцеводами.

Выявлена четкая зависимость интенсивности действия этанола от его концентрации и температуры средыво время активации. Максимальное чис- ло яйцеклеток активируется 4% этанолом при 32.2 0С, при 7%-ной кон- центрации активирующее действие наиболее полно выражено при 24.5 0С. После пересадки активированных этанолом яйцеклеток реципиентам пар- теногенетические эмбрионы достигали стадии морул и бластоцист.

Исследования показали, что партеногенетические зародыши способны формировать бластоцисты, однако партеногенетические бластоцисты в

большинстве случаев не могут имплантироваться или погибают на самых начальных стадиях постимплантационногопериода.

73

Путем анализа динамики развития партеногенетических зародышей было выявлено, что уже на самых ранних стадиях эмбриогенеза партено- гены развиваются слабее, чем оплодотворенные яйцеклетки. Эта разница возрастает и далее вплоть до имплантации. Однако, следует отметить, что диплоидные партеногенетические зародыши развиваются лучше и поги- бают позднее, чем гаплоидные.

До настоящего времени механизм гибели партеногенетических заро- дышей у млекопитающих не выяснен. Высказано предположение, что ги- бель вызвана нарушением темпов дробления, формированием неполно- ценных бластоцист. Гибель партеногенетических зародышей может быть вызвана нестабильностью их кариотипа, появлением хромосомных абер- раций, а также обусловливаться рецессивными летальными мутациями, эффект которых проявляется в гемизиготном состоянии аллелей у гаплои- дов. В последнее время в опытах было показано, что у млекопитающих для завершения эмбриогенеза необходимы как мужской, так и женский пронуклеусы (геномы) и их межхромосомные взаимодействия.

При рассмотрении партеногенеза следует иметь в виду, что у большин- ства видов млекопитающих до сих пор известен только мейотический пар- теногенез, при котором активация яйцеклетки происходит лишь на стадии метафазы II мейотического деления. Это связано с тем, что у многих видов млекопитающих ооциты овулируют на стадии созревания метафазы II. Не- смотря на позднюю активацию яйцеклетки мейотический партеногенез по-

зволяет получать полностью или почти полностью гомозиготных особей в течение одногопоколения.

С помощью новых методов культивирования яйцеклеток и эмбрионов in vitro можно получать партеногенов на более ранних стадиях активации яйцеклеток. Так, выделенные из яичников ооциты сельскохозяйственных животных, находящиеся на стадии диплонемы профазы мейоза, можно культивировать в соответствующих средах до стадий метафазы I и мета- фазы II, после чегоих активируют к партеногенетическому развитию.

Впервые эксперименты по стимуляции яйцеклеток крупного рогатого скота к партеногенетическому развитию были проведены в ВНИИРГЖ. Для культивирования отбирали ооциты, выделенные из яичников коров без морфологических признаков дегенерации. Культивирование проводи- ли в синтетической среде ТС-199, в которую добавляли 20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики при рН среды7.2 –7.4 в атмосфере воздуха, содержащей 5% СО2.

74

Культивируемые ооциты, находящиеся на разных стадиях созревания,

стимулировали к партеногенетическому развитию холодовым шоком при температуре -0…-4 0С в течение 15-36 мин. Затем их прогревали в течение 5 мин. при температуре – 37.5 0С в обычной культуральной среде. После

окончания прогрева продолжали культивирование ооцитов и зародышей до 69 –73 ч.

Результаты экспериментов показали, что наибольший эффект получа- ется при активации ооцитов на стадии метафазы II. Этим исследованием было подтверждено, что у млекопитающих, за исключением нескольких видов, в партеногенетическое развитие вступают зрелые яйцеклетки, на- ходящиеся на стадии метафазы II мейотического деления. В результате проведенныхэкспериментов похолодовому шокуиз ооцитов, находящихся на стадиях метафазы I и метафазы II, получены партеногенетические заро- дыши до стадии ранней морулы.

В связи с тем, чтопартеногенетические эмбрионы погибают на ранних имплантационных стадиях развития, была выдвинута идея использования генетических химер для стимуляции развития партеногенетических эм- брионов.

Важнейшее биологическое свойство генетических химер состоит в том, что нежизнеспособные эмбрионы (партеногены, зародыши с летальными факторами) методом агрегации (соединения) с жизнеспособными эмбрио- нами образовывают клеточные линии химер и могут давать жизнеспособ- ное потомство. Другими словами, соединяясь в состав зародыша – химе- ры, клетки партеногенетического зародыша способны участвовать в раз- витии не только соматических тканей, но и в формировании половых кле- ток, что может привести к созданию партеногенетических клонов. Имеют- ся случаи рождения химерных мышей, сохранивших жизнеспособность и воспроизводительныеспособности.

Несмотря на проведенные исследования, механизм партеногенетиче- ского развития у крупного рогатого скота еще полностью не познан. Толь-

ко окончательное раскрытие механизма партеногенетической активности ооцитов приведет к разработке надежного метода клонирования, получе- нию почти полностью гомозиготных потомков (мейотический партеноге- нез) или получению генетических копий матери (амейотический партено- генез). С помощью клонирования можнобудет ускоренными темпами соз- давать генетические линии в племенном скотоводстве и популяции иден-

тичных особей с нужными генотипами для эффективного производства молока и мяса в промышленном скотоводстве.

75

5.3. Получение идентичных монозиготных близнецов. Одним из перспективных приемов клеточной инженерии в животноводстве – полу- чение генетически идентичных близнецов. Идентичные, или монозигот- ные, близнецы, полученные из одной оплодотворенной яйцеклетки – зи- готы, имеют одинаковый генотип. Вероятность появления таких генетиче- ски идентичных близнецов крайне низкая и составляет всего 0,01%.

Первые эксперименты по искусственному получению идентичных (мо- нозиготных) близнецов у млекопитающих на основе микроманипуляций с ранними эмбрионами были проведены в 30-40-е годы на кроликах и кры- сах. Было показано, что изолированные друг от друга два бластомера мо- гут дробиться и нормально развиваться в матке самки-реципиента. Этим было доказано, что каждый изолированный бластомер способен разви- ваться в самостоятельный эмбрион, то есть проявлять тотипотентность.

Микроманипуляция на зиготах кроликах проводилась по упрощенной схеме. Извлеченные из яйцеводов черной самки кролика зиготы на двух- клеточной стадии деления подвергались простой хирургии – уколом тон- кой стеклянной иглы один из бластомеров разрушался. При культивиро- вании в питательной среде было установлено, что оставшийся неповреж- денный бластомер продолжал нормально дробиться, в результате чего он развивался в самостоятельный многоклеточный эмбрион. При трансплан- тации изолированных бластомеров зиготы черной самки крольчихам чис- топородной серой породы рождались крольчата толькос черной окраской.

В другом случае деление эмбрионов мышей проводили на более позд- ней стадии – морулы, состоящей уже из 8-16 бластомеров. Зону пеллюци- да удаляли путем разрезания или протеолитическим ферментом проназой. Освобожденную от зоны пеллюцида морулу разделяли микроманипуля- тором на половинки. В результате из 80 половинок было получено 30 мы- шат, в т.ч. 40% из них оказались однояцевыми близнецами. Эксперименты показали, что деление эмбрионов на половинки можно производить на ста- диях морулы или бластоцисты.

Первые эксперименты по получению идентичных близнецов были про- ведены на овцах. Извлекали двухклеточные эмбрионы из суперовулиро- вавших овцематок. Зону пеллюцида вскрывали с помощью стеклянной иглы. Эмбрионы разделяли микрохирургически на две половинки, затем оба бластомера переносили сначала в малый, а затем в большой агаровый цилиндр. Агаровые цилиндры трансплантировали в лигатированный яй- цевод промежуточного реципиента (овца). Эмбрионы, развившиеся до стадий морулы или бластоцисты, извлекали из яйцеводов промежуточно-

76

го реципиента. После освобождения от агара и морфологической оценки пересаживали эмбрионы основным реципиентам. Из 16 реципиентов 11 оказались суягными. От 10 овец, у которых суягность проходила норма- льно, было получено пять идентичных близнецов. Индетичные близнецы могут быть получены из 4 и 8-клеточных эмбрионов овцы.

Были проведены исследования по получению идентичных двоен у крупного рогатого скота с помощью микрохирургического деления 5-6 дневных эмбрионов, находящихся на стадии морулы. Нехирургическим методом исследователи извлекали морулы из суперовулировавших по- месных коров, полученных от межпородного скрещивания. У эмбрионов микрохирургически разрезали зону пеллюцида (прозрачная оболочка) и делили обнаженные эмбрионы. Половинки вносили в агаровые цилиндры

и культивировали до стадии бластоцисты в лигатированных яйцеводах овец. Затем половинки освобождали от агара и проводили жесткий отбор по морфологическим признакам и жизнеспособности. Нормально раз-

вившиеся половинки пересаживали хирургическим методом в оба рога матки синхронизированным коровам – реципиентам. Всего из 28 переса- женных половинок был получен 21 здоровый теленок.

Впоследнее время уделяется большое внимание разделению 8- суточ- ных эмбрионов, находящихся на стадии бластоцисты. В среднем из 10

отобранных эмбрионов пригодным для получения идентичных близнецов считается только один эмбрион.

ВГермании для разделения использовали 7-суточные эмбрионы на

стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты. Разделенные половин- ки эмбрионов культивировали в течение 2 ч, затем их трансплантировали нехирургическим методом коровам – реципиентам. Стельность коров – реципиентов от пересаженных половинок эмбрионов составила 71%.

По мнению специалистов, разделение эмбрионов на половинки явля- ется дополнительным приемом в программах по трансплантации эмбрио- нов, увеличивающим число потомков от генетически ценных коров – до- норов. В практических условиях деление эмбрионов может быть проведе- но в передвижной лаборатории. Извлеченные эмбрионы доставляют в ла- бораторию для оценки и деления. Половинки эмбрионов хорошего каче- ства трансплантируют коровам – реципиентам.

В ВИЖе эмбрионы для деления получают от коров – доноров на 6-7 сутки после суперовуляции и осеменения. Микроманипуляции осуществ- ляют в среде Дюльбекко с добавкой 20% фетальной сыворотки плода и антибиотиков. В исследованиях используют микроманипулятор «Ляйц» с

77

набором микрохирургических инструментов: удерживающая пипетка – для фиксации эмбриона, микроскальпель (микролезвие) – для вскрытия зоны пеллюцида и разделения внутренней клеточной массы, тонкие стек- лянные иглы и инъекционные микропипетки разного диаметра – для пе- ресадки половинок эмбрионов. Всего методом микрохирургического де- ления эмбрионов получено16 телят, в т.ч. четыре идентичные двойни.

Увеличение числа эмбрионов путем их деления создает проблему со- хранения половинок эмбрионов. Наилучший способ хранения – глубокое замораживание (криоконсервация). Разработка такого метода позволит транспортировать половинки эмбрионов на дальние расстояния, создавать большие массивы генетически идентичных двоен. Этот метод эффективен при оценке племенной ценности быков. После проведения оценки генети-

ческие копии быков можно извлечь из замораживающего устройства и получить идентичныхпогенотипубыков-улучшателей.

Метод трансплантации разделенных эмбрионов вступил в новую фазу развития, когда индетичных близнецов можно получать от замороженно- оттаянных половинок эмбрионов.

Контрольные вопросы: 1.Чтотакоеклонирование?

2.Назовите методы клонирования эмбрионов у крупного рогатого скота и других видов животных.

3.Какие этапы включает общая схема клонирования животных?

4.Чтотакоепартеногенез?

5.Чтотакое андрогенез, гиногенез?

6.Расскажите о методах создания партеногенетических животных.

6.Какие стимуляторы используются для активирования яйцеклетки млекопитающих к партеногенетическомуразвитию? 7.Какие известны механизмы диплоидизации партеногенеза? 8.Как получают идентичных монозиготных близнецов?

ГЛАВА6. ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХЖИВОТНЫХ.

6.1.Методы создания экспериментальных химер. Термин «химера»,

или генетический мозаик, используется главным образом для получения организмов, состоящих из генетически различных клеточных популяций, происходящих более чем от одной оплодотворенной яйцеклетки. С узко-

78

генетической точки зрения химеры – это продукты объединения двух и более ранних эмбрионов, вследствие чего они обладают сложным комби- нированнымгенотипом.

По классификации К.Форда, различают первичный и вторичный химеризм. При первичном химеризме генетически разные популяции клеток сосуществуют с момента оплодотворения яйцеклетки или раннего эмбриогенеза. Первичные химеры с крайне низкой частотой могут возникать, например, когда два или несколько спермиев оплодотворяют одну яйцеклетку. Первичных химер можно получать искусственно.

При вторичном химеризме происходят комбинации одногодвух видов тканей от двух или более зародышей после начала глубокой клеточной дифференцировки. Вторичный химеризм характерен для химер естественного происхождения.

В современной биотехнологии для получения химер используют кате- горию первичного химеризма. Суть такой технологии заключается в ис-

кусственном объединении двух или более генетически различных ранних эмбрионов или введении клеток внутренней клеточной массы бластоци- сты донора в бластоцель зародыша – реципиента. Полученные химеры не- сут свойства разных генотипов и в своем происхождении будут иметь че- тырех родителей и более.

На химерах можно выявить процессы дифференцировки тканей и ме- ханизмы развития животного, начиная от ранних эмбриональных стадий; особенности экспрессии генов на клеточном уровне; межклеточные взаи- модействия иплейотропный эффект генов.

Химер относят к вегетативным гибридам, полученным в результате объединения геномов без мейоза. Они не передают потомкам характерную только для них генетическую мозаичность. Химеры сохраняют признаки

исвойства исходных форм лишь в одном поколении. Химеры могут соче- тать ценные в хозяйственном отношении признаки, которые отсутствуют у обычных животных или слабо выражены. Это касается антагонистиче- ских признаков, как, например, молочная и мясная продуктивность круп- ного рогатого скота, качество шерсти и мясная продуктивность овец и т.д. Создание инъекционных химер методом введения в ранний эмбрион оп- ределенных линий клеток позволит улучшить иммунную систему и повы- сить резистентность животных к болезням.

Существуют два основных метода получения химер – агрегационный

иинъекционный. Впервые эти методы были разработаны на лабораторных

79

мышах и позднее применены к разным видам сельскохозяйственных жи- вотных.

1.Агрегационный метод. Он основан на объединении дробящихся эм- брионов. Метод разработан В.Тарковским и Минц Б. (1961-62 г.г.) для по- лучения химерных мышей. Для идентификации агрегационных химер мы- шей, полученных из разных линий, применяют символ ↔. Так, например, А ↔ В означает, что химера получена на основе агрегации эмбрионов мышей, относящихся к линиям А и В.

Суть метода состоит в следующем. Из яйцеводов самок извлекают эм- брионы, различающиеся генотипами на стадии 8-12 бластомеров. Зону пел- люцида, покрывающую эмбрионы, удаляют механически или ферментативно проназой. После освобождения из зоны пеллюцида морулы с разными гено- типами сближают с помощью стеклянной микроиглы или микропипетки. Сбли- жение и агрегацию эмбрионов проводят в капле среды, покрытой слоем пара- финового масла в культуральном сосуде на обогреваемом столике микроско- па.

После агрегации эмбрионы культивируют в течение 24-48 ч в пита-

тельных средах при t 0– 370 С. Для культивирования применяют пита- тельную среду Бринстера (состоящую из забуференного бикарбонатом солевого раствора типа Кребса–Рингера с добавлением источников энер- гии – пируват, лактат, глюкоза, бычьего сыворотного альбумина, пени-

циллина и стрептомицина). При культивировании in vitro химерные заро- дыши достигают стадии бластоцисты, и их имплантируют в матку мыши

– реципиента, которую за 2,5 – 3 дня до этого спаривают со стерильным (вазоэктомированным) самцом.

Химеры, полученные агрегационным методом, могут происходить не только от двух целых эмбрионов. Имеются случаи получения химер путем объединения 16 эмбрионов. При этом масса химерных эмбрионов не бы- вает большей, чем у обычных, так как она подвержена действию эмбрио- нальной регуляции. В то же время часть эмбрионов и новорожденных мышей, полученных этим методом, не проявляют характерных для химер- ных организмов признаков и свойств. У таких животных все ткани и орга- ны сформированы из клеток, происходящих от одного исходного геноти- па.

Следует особо отметить слабую имплантацию в стенку матки реципи- ента пересаженных химерных бластоцист, а также значительную их ги- бель во время пренатального периода. Частота рождения химерных мы-

80