Диагностика.

Диагностика пироплазмоза собак содержит в себе определенные трудности, связанные с наличием атипичных форм болезни и необхо­димости дифференцировки от других заболеваний собак.

Морфологи­ческий метод диагностики пироплазмоза собак является наиболее точным и совершенным.

Морфологический метод включает в себя:

1. Патологоанатомический метод— исследование макроскопичес­ких изменений органов и тканей.

2. Патологогистологический метод — исследование микроскопи­ческих изменений органов и тканей (кроме крови).

3. Гемоцитологический метод — исследование изменений клеток крови.

Поставить диагноз на пироплазмоз собак можно лишь комплексно, используя:

патологоанатомический + гемоцитологический методы; либо па­тологогистологический + гемоцитологический методы.

Само по себе обнаружение паразитов без определенных морфологи­ческих изменений в органах и тканях собаки не может быть доказа­тельством пироплазмоза, а лишь свидетельствует о наличии пироп­лазм в организме — о пироплазмоносительстве.

1. Гемоцитологический метод диагностики

1.1. Кровь для и з г о т о в л е н и я м а з к а берут у взрослых собак из кровеносных сосудов уха, у щенков — из сосудов хвоста. Чтобы получить мазок хорошего качества, необходимо взять чистое, обезжиренное в спирт-эфире предметное стекло, нанести на него первую каплю крови, шлифованное стекло установить под углом 35-45° и, когда капля равномерно распределится вдоль его нижнего ребра, плавно размазать кровь по предметному стеклу.

Пироплазмы в мазках крови собаки:

1 – в эритроцитах; 2 – свободные в плазме; 3 – на лимфоцитах; 4 – в нейтрофилах.

Патология крови: 5 – звездчатые эритроциты; 6 – лейкоциты в состоянии некробиоза.

М а з к и - о т п е ч а т к и готовят в процессе вскрытия трупов животных, прижимая чистое обезжиренное стекло к поверхности свежего разреза органа. При подозрении на пироплазмоз собак делают мазки-отпечатки лимфоузлов, селезенки, печени, почек, миокарда и легких. Мазки крови и мазки-отпечатки органов высушивают и фиксируют в метиловом спирте 3-5 минут.

1.2. Окраска мазков и мазков - о т п е ч а т к о в п о Р о м ан о в с к о м у - Г и м з а производится краской, состоящей из азура П — 3,0 г, эозина В — 0,8; глицерина и метилового спирта — по 250,0 мл. Мазки крови (мазки-отпечатки) погружают в рабочий раствор (1 мл дистиллированной воды + 1-3 капли краски) на 20-40 минут, затем промывают под струей воды, сушат и проводят микроскопирование.

1.3. Для окраски м а з к о в и мазков - о тпе ч а т к о в п о Браше 20 мг очищенного в хлороформе метилового зеленого раст­воряют в 4 мл дистиллированной воды и 90 мг пиронина Ж - в 9 мл дистиллированной воды и к ним прибавляют 12 мл дистиллированной воды и 25 мл 0,1-нормалыюго ацетатного буфера с рН = 5,6; мазки помещают в эту краску на 3-5 минут, после чего промокают фильтровальной бумагой.

1.4. Микроскопическое исследование мазков крови и мазков-отпечатков внутренних органов проводят в иммерсионной системе микроскопа (об. х 90 или х 100).

1. P. canis — паразит, имеющий в мазках грушевидную, овальную, округлую или амебовидную форму, размер — от половины радиуса до диаметра эритроцита: округлые диаметром 2,0-4,2 мкм, грушевидные- величиной 3,1-5,3 х 1,9-3,1 мкм. Количество пораженных эритроцитов достигает 6-10%. В одном эритроците может располагаться 1,2,4,8,16,32 пироплазмы. Пироплазм обнаруживают в эритроцитах, свободнолежащими в плазме, в нейтрофилах, моноцитах, на поверхности лимфоцитов. Каким бы способом ни был окрашен мазок, пироплазмы не светятся насквозь. При вращении микровинта паразит «исчезает» и «появляется» вместе с эритроцитом (лейкоцитом), в который он заключен.

2. В мазках крови, окрашенных по Р о м а н о в с к о м у - Г и м з а, пироплазмы имеют дымчато-голубую цитоплазму, причем в центре более светлую, чем по периферии, и рубиново-крас­ный хроматин, чаще всего располагающийся в виде двух небольших ядер. В эритроците вокруг пироплазмы непременно имеется зона просветления. Лейкоциты при пироплазмозе собак имеют размытые, окрашенные в бледно-синие тона ядра и нечеткие границы цитоплаз­мы, за исключением менее дистрофированных — лимфоцитов. В цитоплазме моноцитов находятся красно-фиолетовая зернистость и прозрачные вакуоли. Эритроциты бледно-розовые с белым прозрач­ным центром - гипохромные. Часто встречаются эритроциты с зуб­чатыми краями, с базофильной зернистостью, различного размера — в основном больше нормы. Нередкий случай — диффузная окраска мазка в розовый цвет — свидетельство лизиса эритроцитов.

3.Окраска мазков крови по Браше позволяет очень точно дифференцировать пироплазм от сходных структур, от «грязи», так как этим методом окрашиваются только нуклеиновые кислоты: ДНК - в сине-зеленый цвет, РНК — в розово-сиреневый. Пироплазмы чаще всего имеют розовую цитоплазму и сине-зеленый хроматин. Лейкоциты бедны нуклеиновыми кислотами: ядра их бледно-зеленые, цитоплазма светло-розовая или не окраши­вается. Эритроциты приобретают фоновую желтовато-розовую окрас­ку. Итак, для того, чтобы с помощью мазков крови подтвердить диагноз - пироплазмоз собак - необходимо обнаружить пироплазм и патологию крови: анизоцитоз, пойкилоцитоз,.гипохромазию эритроцитов, дистрофию лейкоцитов.

Пироплазмы в мазках-отпечатках внутренних органов:

1 – в эритроцитах; 2 – свободные в плазме; 3 – на лимфоцитах;

4 – в нейтрофилах; 5 – в макрофагах.

4. П р и и ссле д о в а н и и м а з к о в - о т п е ч а т к о в, о к р а ш е н н ы х п о Р о м а н о в с к о м у - Г и м з а, в лимфоузлах отмечают множество мутных, бледно-голубых, с нечеткими границами лимфо­цитов; единичных свободнолежащих пироплазм грушевидной фор­мы. Также пироплазм обнаруживают в макрофагах и на поверхности лимфоцитов. В селезенке эритроциты лизированы, лейкоциты нахо­дятся в состоянии некробиоза: мутные, едва различимые. Отмечают множество пироплазм, недостаточно четко очерченных.

В мазках-отпечатках печени в клетках Купфера обнаруживают крас­ные включения. Пироплазмы преимущественно округлой формы. Эритроциты находятся в состоянии глыбчатого распада. Встречаются лимфоциты с «прилипшими» к поверхности пироплазмами.

Больше всего пироплазм в поле зрения микроскопа отмечают в отпечатках почек. В некоторых эритроцитах содержится по 8,16 и 32 округлых или грушевидных пироплазм.

В миокарде локализуются редкие скопления паразитов, грушевид­ных и округлых, свободнолежащих, так как эритроциты обычно быс­тро лизируются; или отдельные паразиты на поверхности лимфоци­тов.

В мазках-отпечатках легких присутствует множество крупных (4-7 мкм х 2 мкм) пироплазм, располагающихся в эритроцитах и альвео­лярных макрофагах.

5. При и с с л е д о в а н и и м а з к о в - о т п е ч а т к о в, о к р а ш е н н ы х п о Б р а ш е в лимфоузлах обнаруживают розовых (РНК- содержащих) свободнолежащих и надлимфоцитарных пироплазм, а ДНК-содержащих — в эритроцитах и нейтрофилах. В селезенке на лимфоцитах, в эритроцитах и вне клеток пироплазмы либо ДНК-, либо РНК-содержащие.

В печени в большинстве случаев обнаружены ярко-зеленые, богатые ДНК, одиночные пироплазмы — в эритроцитах и свободнолежащие в плазме. В лимфоцитах, находящихся в печени, паразиты бедны ДНК, но встречаются и розовые грушевидные пироплазмы с зелеными ядрами.

В почках пироплазмы окрашиваются в сиреневый цвет с зелеными ядрами, здесь обнаруживают скопления округлых розовых пироп­лазм.

В миокарде регистрируют множество классических пироплазм в эритроцитах, а также паразитов с преимущественным содержанием ДНК или РНК, причем РНК-содержащие в два раза крупнее.

В легких находится грушевидные свободнолежащие, одиночные и парные пироплазмы с большим содержанием РНК.