2.1. Определение видовой принадлежности дрожжей

Для идентификации дрожжей необходимо исследование комплекса морфологических и физиологических признаков. Морфологические свойства включают образование аскоспор, характер вегетативного размножения, форму и размер клеток, макроморфологические признаки.

Образование аскоспор. Дрожжи образуют споры на плотных средах, обедненных какими-либо питательными веществами. Для выявления спор используют специальные среды, среди которых наиболее распространенной является среда Городковой (10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 20 г агара, водопроводная вода до 1 л; рН среды 7,3.Исследуемые культуры наносят штрихом на поверхность скошенной в пробирках среды и инкубируют при 30 С в течение 7 сут, после чего просматривают под микроскопом.

Макроморфологические признаки дрожжей изучают по внешнему виду колоний и форме штриха на солодовом агаре после инкубации в течение 7 сут при 30 С. При описании колоний отмечают их вид, цвет, размер, форму, поверхностный узор.

При изучении физиологических свойств отмечают образование пленки в жидкой питательной среде, ферментацию сахаров; ассимиляцию углеводов, спиртов, органических кислот и нитратов; образование крахмалоподобных соединений.

Образование пленки исследуют при культивировании дрожжей в жидких средах: ее толщину, «вползание» по стенке; характер пристеночного кольца, осадка, мути.

Ферментация сахаров. Способность к сбраживанию углеводов является одним из основных признаков при идентификации дрожжей. Оценку процесса ферментации проводят при культивировании дрожжей в жидкой питательной среде, в которую помещен поплавок для скопления выделяющегося при брожении газа. Для этого используют дрожжевую воду, в которую внесен один из исследуемых сахаров.

Ассимиляция углеводов, спиртов, органических кислот – также важный признак при идентификации дрожжей. Для определения способности дрожжей к ассимиляции используют следующую среду: 0,5 % (NH₄)₂SO₄; 0,1 % KH₂PO₄; 0,05 % MgSO₄  7H₂O; 0,1 % дрожжевого автолизата, 3 % промытого агар-агара, к которой добавляют 1 % соответствующего сахара. Посев дрожжей проводят штрихом на агаризованную среду в пробирках или чашках Петри. Способность дрожжей к усвоению того или другого соединения определяют визуально по интенсивности роста в сравнении со средой без сахара.

В настоящее время для идентификации штаммов одного вида широко используют методы анализа ДНК путем электрофореза в пульсирующих разнонаправленных электрических полях (пульс-элект-рофорез). Имея размеры фрагментов ДНК, полученных при обработке нативной ДНК эндонуклеазами рестрикции и разделенных электрофорезом, возможно построить макрорестрикционные карты хромосом, которые отражают порядок расположения на хромосоме фрагментов ДНК известного размера, ограниченных сайтами рестрикции и составить физическую карту хромосомы.

2.2. Микробиологический анализ музейных культур

Периодически (не реже одного раза в квартал и перед рассылкой на дрожжевые предприятия) промышленные штаммы анализируют на микробиологическую чистоту и сохранение производственно-ценных свойств. Проверку на наличие в пробирочных культурах бактерий и посторонних дрожжей осуществляют посевом на селективные плотные питательные среды. В случае обнаружения бактерий культуру дрожжей обрабатывают антимикробными препаратами, после чего посевы на селективные среды повторяют.

При проверке музейных культур на наличие посторонних дрожжей используют синтетическую среду с лизином. Надежным способом очистки от посторонних дрожжей является рассев культур на поверхность плотной питательной среды с целью получения изолированных колоний хлебопекарных дрожжей. Для получения изолированных колоний используют один из двух следующих методов:

Рассев с помощью шпателя. Каплю дрожжевой суспензии помещают на поверхность сусло-агара в чашке Петри, равномерно растирая ее стерильным стеклянным шпателем. Затем, не обжигая шпатель в пламени горелки, растирают им последовательно поверхность второй и третьей чашки Петри.

После рассева дрожжи инкубируют при 26–28 С в течение 3–5 сут. Как правило, на поверхности питательной среды последней чашки дрожжи растут в виде изолированных колоний (рис. 2.1).

б

а

в

Рис. 2.1. Рассев культуры на поверхность плотной среды шпателем: а – шпатель Дригальского; б – рассев; в – рост микроорганизмов после рассева

Рассев истощающим мазком. Каплю дрожжевой суспензии с помощью микробиологической петли наносят на поверхность плотной питательной среды, содержащейся в чашке Петри, и растирают ее петлей на ¼ поверхности. Затем, не обжигая петлю в пламени горелки, в той же чашке последовательно на остальных частях среды проводят ряд штрихов. На последних штрихах дрожжи вырастают обычно в виде изолированных колоний. Дрожжи из 20–30 изолированных колоний переносят в солодовое сусло, инкубируют в течение 24 ч при температуре 26–28 С, затем пересевают на скошенный сусловой агар (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Схемы рассева культуры петлей на поверхность плотной среды