Гель, що мiстить антитiла

Кiльця преципiтацiї

(Дiаметр

кiльця) ²

Концентрацiя антигена (напр., ІgG, що мiститься в сироватцi)

Рис. 4.1Схема реакцiї радiальної iмунодифузiї за Манчінi

Вихiдний розчин

антитiл

По 20 мкл фiзiологiчного розчину

Розведення

1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

Рис. 4.3. Розведення антитiл

Принцип методу простої радіальної імунодифузії за Манчіні

Рис. 4.4. Послідовність виконання радіальної імунодифузії

Метод радiальної iмунодифузiї був запропонований Г. Манчінi разом iз спiвавторами у 1963 р. Метод використовують в основному для кількісного визначення антигенів. Найчастіше досліджують білкові антигени, наприклад білки сироватки крові, цереброспинальної рідини, секретів залоз, екстрактів з органів тощо. Метод набув широкого поширення в клінічних біохімічних лабораторіях.

На рівну поверхню рівномірним шаром наносять гель, що містить антитіла. В гелі вирізають лунки і заповнюють їх розчином антигену. Молекули антигену радіально дифундують з лунки, i зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. До тих пір, поки в лунці зберігається надлишок антигенів, діаметр кільця преципітації поступово збільшується. Послідовність дій вказана на Рис 4.4.

Побудова калібрувальної кривої. Діаметр кілець знаходиться в лінійній залежності від концентрації антигену лише в тому випадку, якщо реакція продовжується декілька днів і повністю закінчується. У разі, коли результати враховують через 24 год після початку реакції, можна побудувати графік залежності діаметру кілець від логарифма концентрації антигену. Даний метод дозволяє отримати на графіку майже пряму лінію. Можна також побудувати графік залежності квадратів діаметру кілець від двократних розведень стандартної сироватки або від зменшення концентрацій антигену.

Вимірювання кілець преципітації на вологих препаратах.

У багатьох випадках можна враховувати результати на вологих препаратах. Вимір проводять за допомогою вимірювального пристрою, який прикладають до зворотної сторони скла.

Кільця преципітації можна вимірювати також після висушування і фарбування гелів. Висушування слід проводити обережно, щоб кільця преципітації не змінили форму і розміри.

Завдання на виконання:

1. Готують розчини антисироваток, що знаходяться в ліофілізованому станi в ампулах (робочі титри вказані на ампулі, наприклад 1:20). Необхідно приготувати половинні розведення антисироваток на фізіологічному розчині (наприклад 1:10), оскільки надалі вони зливатимуться в співвідношенні 1:1 з розплавленим агаром і їх кінцевий титр відповідатиме вказаному на ампулі.

2. Розплавляють 3%-й агар на фізіологічному розчині і колбу з агаром поміщають у водяну баню за 50°C.

3. Підігрівають чашку Петрі, піпетки (у термостаті за температури 37°С), щоб шар агару з антисироваткою рівномірно розподілився по поверхні скла. Антисироватку з половинним титром також нагрівають до 50°C.

4. Приготувати камеру (чашку Петрі) для заливання агару. Камеру підігріти до 57С. На камеру нанести помітку відповідного класу імуноглобулінів.

5. В хімічну пробірку внести 6 мл фіз. розчину, попередньо нагрітого на водяній бані до 56С, до нього додати 1 мл розведеної антисироватки одного з класів імуноглобулінів і з’єднати з 7 мл агару, нагрітого до 56С. Суміш акуратно залити в камеру. Суміш застигає упродовж 10 хв. Процедуру повторити для всіх класів імуноглобулінів.

5. У товщі агару пробійником вирізають лунки діаметром 2 мм на відстані 15 мм одна від одної. На склі роблять декілька рядів лунок. У лунки одного ряду вносять за допомогою мікрощприца 2 мкл нерозведеної стандартної сироватки (контрольна сироватка з відомою концентрацією імуноглобулінів), а також її розведення 1: 2; 1:4; 1:8, 1:16 (Рис. 4.2). Лунки іншого ряду заповнюють досліджуваними сироватками (тобто тими, в яких необхідно визначити концентрацію імуноглобулінів)

6. Чашки Петрі інкубують у вологій камері упродовж 24 годин (для Ig M – 48 год). Після закінчення інкубації вимірюють діаметри кілець преципітації вимірювальним приладом (бінокулярна лупа, окулярний мікрометр, лінійка, лупа) та за калібрувальною кривою визначають кількість імуноглобулінів у досліджуваній сироватці.

7. Провести фарбування мазків крові (лаб. роб. №3): мазки фіксують метанолом 1 – 2 хв; потім нанести фарбу Романовського-Гімзе на 15 – 17 хв, змити у дист. воді. Промікроскопіювати з імерсією (90): визначити відсоток Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та О-клітин.

8. Оформити протокол заняття, зробити висновки.