Контрольні запитання:
Які основні методи досліджень лімфоцитів Ви знаєте, їх зміст?
Які кластери диференціації мають Т-лімфоцити, В-лімфоцити, Т-хелпери та Т-цитотоксичні лімфоцити.
Яке значення має визначення субпопуляції Т-лімфоцитів?
Тестові завдання:
4.1. За допомогою якого методу визначають кількість Т-лімфоцитів?
А. Реакція бласттрансформації.
Б. Метод розеткоутворення з еритроцитами миші.
В. НСТ-тест
Г. Метод розеткоутворення з еритроцитами барана.
4.2. За допомогою якого маркеру визначають субпопуляцію Т-хелперів?
А. CD 1
Б. CD 4
В. CD 8.
Г. CD 16.
4.3. За допомогою якого маркеру визначають субпопуляцію природних кілерів?
А. CD 1
Б. CD 4
В. CD 8.
Г. CD 16.
4.4. За допомогою якого методу визначають кількість В-лімфоцитів?
А. Реакція бласттрансформації.
Б. Метод моноклональних антитіл до CD.
В. НСТ-тест
Г. Метод розеткоутворення з еритроцитами барана.
Правильні відповіді на тестові завдання:
4.1. Г.
4.2. Б.
4.3. Г.
4.4. Б.
Лабораторна робота № 4 кількісне визначення антитіл методом локального гемолізу в гелі
Мета роботи: навчитися визначати концентрацію IgG, IgM i IgA в сироватці крові людини; навчитися будувати калібрувальну криву для визначення концентрації імуноглобулінів.
План:
1. Антитіла та їх молекулярна структура. Антигенні властивості антитіл.
2. Просторова структура важких і легких ланцюгів і організація четвертинної структури антитіл. Доменна будова імуноглобулінів.
3. Активний центр антитіл та його організація. Імуноглобуліни та їх секреція. Катаболізм імуноглобулінів.
4. Біосинтез молекул імуноглобулінів. Теорії утворення антитіл. Антитіла класів M, G, A, D, E.
5. Моноклональні антитіла.
6. Механізми зв’язування антигенів з антитілами. Значення компліментарності паратопа і епітопа. Афінність. Авідність.
7. Антиген як функціональний термін. Джерела і хімічна природа антигенів.
8. Специфічність і імуногенність. Фактори, що визначають антигенний потенціал і його реалізацію.
9. Антигени, гаптени, носії та їх хімічна природа.
10. Тимусзалежні та тимуснезалежні антигени.
Матеріали та обладнання: стандартна сироватка крові людини з відомими концентрацiями IgG, IgM і IgA (антигени); моноспецифічні антисироватки; тестовані сироватки крові людини; 2,5%-й агap на фізіологічному розчині; волога камера; вимірювальний інструмент з точність до 0,1 мм; піпетка або шприц, що дозволяють дозувати об’єми від 1 до 10 мкл; пробійник з внутрішнім діаметром 2 мм для формування лунок в агарі.
Загальні відомості
Антитіла (АТ) – це особливі розчинні білки з певною біологічною структурою (імуноглобуліни), які присутні в сироватці крові і інших біологічних рідинах, які організм виробляє для зв’язування різноманітних антигенів. Всі без виключення АТ належать до одного типу білкових молекул, які мають глобулярну вторинну структуру, тому цей тип молекул називається імуноглобулін. Тобто всі АТ – імуноглобуліни. Міжнародна абревіатура імуноглобулінів – Ig.
Заглавна літера поряд з Ig означає один із п’яти класів імуноглобулінів, які існують у ссавців – M, G, A, E, D. Наступна арабська цифра означає підклас. Підкласи існують тільки у імуноглобулінів класів G (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5) та А (IgА1, IgА2). Класи і підкласи називаються ізотипами імуноглобулінів. Таким чином, ізотипів 10.
Молекула антитіла складається з двох типів поліпептидних ланцюгів: важких (Н – hight) та легких (L – light). Важкі ланцюги поділяються на класи: α (альфа), μ (мю), γ (гамма), δ (дельта), ε (епсілон) і відповідно розрізняють п’ять класів IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Для легких ланцюгів виділяють типи k – каппа і λ – лямбда.
Легкий та важкий ланцюг має G-кінець та N-кінець (С- СОО- - залишок карбоксильної групи АК, N-кінець залишок аміногрупи NН3+).
Легкі ланцюги приєднані до N-кінця важких ланцюгів, С-кінець важких ланцюгів формує Fc-фрагмент молекули Ig.
Рис 4.1. Структура молекули імуноглобуліну.
Активний центр АТ формується важким і легким ланцюгом. Це стало відомо після досліджень англійського вченого Р. Портера та американського вченого Г. Едельмана у 1959 році. Портер обробив АТ папаїном і отримав 3 фрагмента. Два з яких з молекулярною масою 45000 Д ідентичні один одному і їх назвали Fab1 та Fab2 тобто фрагменти, які з’єднували антиген (antigen binding). Третій фрагмент з молекулярною масою 55000 Д специфічної активності не мав, але мав постійний амінокислотний склад і був названий Fc-фрагментом (crystallizable).
Коли ж Г. Едельман обробив АТ меркаптоетанолом у концентрованому розчині сечовини, то молекула імуноглобуліну розпалась на 2 легкі ланцюги з М.М. 20000 – 25000Д та 2 важкі ланцюги з молекулярною масою 50000Д кожний. Повноцінну активність АТ не один із ланцюгів не мав, тобто було встановлено, що активний центр формується важким та легким ланцюгом. АТ мають два активних центра і відповідно двовалентність, яка забезпечує можливість приєднуватися до них великій кількості антигенів (АГ). Реакція АГ-АТ максимально відбувається тільки в певному діапазоні концентрацій обох реагентів, тобто у зоні еквівалентності і має деякі фізико-хімічні характеристики:
а) наявність електролітів – 0,85% NaСl, рН близьке до нейтральних значень;
б) швидкість реакції з’єднання АГ з АТ, яка відбувається в перші секунди, а проявляється реакція через кілька годин;
в) реакції з’єднання АГ з АТ – зворотні. При зміні рН у лужний або кислотний бік та підвищення концентрації NaСl до 15%, а температури до 60°С можна із комплексу АГ-АТ виділити АТ;
г) при взаємодії АГ з АТ виділяється невелика кількість тепла.
В утворені комплексу АГ-АТ приймають участь електростатичні та міжмолекулярні сили, що діють на близькій відстані. Антитіла визначають в реакціях аглютинації (пряма , непряма), реакціях преципітації (у рідкому середовищі та твердому – агарі), реакції зв’язування комплементу, гель фільтрації, електрофорезу. Визначають антитіла імуноферментним та імунофлуоресцентним методом.
Характеристика різних класів імуноглобулінів. Активовані В-Лф в першу чергу секретують Ig M. Ig M складають приблизно 7% сироваткових Ig. Це досить крупні молекули, які складаються з 5 звичайних мономерних одиниць, зв’язаних j-ланцюгом.
Завдяки такій конструкції Ig M – пентамер має 10 активних центрів і міцно зв'язується з АГ, які несуть епітопні повтори. Такі АГ є на поверхні більшості бактерій і вірусів, тому Ig M є першим бар’єром на шліху інфекції. Хоча Ig M має невисоку спорідненість до АГ, завдяки олігомерності легко викликає аглютинацію мікробних клітин, що сприяє їх знищенню макрофагами. Так звані “нормальні антитіла”, присутні в крові здорових індивидів, теж є здебільшого Ig M. Це антитіла екстремального імунного захисту.
Рис. 4.2. Структура Ig M людини
Ig G – це головний імуноглобулін сироватки крові і тканинних рідин. Приблизно 75% сироваткових імуноглобулінів – Ig G. Більшість антитіл при вторинній імунній відповіді – це Ig G. Вони володіють різними ефекторними функціями: підсилення фагоцитарних реакцій, активація комплементу, активний транспорт через плаценту, нейтралізація мікроорганізмів та їх токсинів. Цьому сприяє тривалий (близько 20 діб) період напіврозпаду (для імуноглобілінів інших класів – 2-10 діб).
Підкласи Ig G відрізняються за своїми властивостями (Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4, Ig G5). Класичним носієм властивостей антитіл є Ig G1, на долю якого припадає 50 – 70% від всієї кількості сироваткових Ig.
За вмістом в сироватці та тканинних рідинах Ig А посідає 2 місце після Ig G. ≈ 15 – 20% всіх Ig сироватки, але лідирує в зовнішніх секретах (слина, сльози, травні соки, молозиво, молоко) та в секретах слизових оболонок (мигдалики). Більшість молекул сироваткового Ig А представлені мономерною (звичайною) формою. Секреторний Ig А (sIgA) – димер, який складається з двох молекул Ig А, що з’єднані j-ланцюгом. Крім того, він містить додатковий пептид, який називається секреторним компонентом (S-компонент). Секреторні Ig А слугують важливим фактором захисту слизових оболонок від бактерій та вірусних інфекцій.
Рис. 4.2. Структура sIgA людини
Ig А людини поділяється на 2 підкласи: Ig А1 та Ig А2. Вони розрізняються за чутливістю до протеолітичних ферментів і розподіленню в організмі. Деякі бактерії, які паразитують на слизових оболонках, утворюють протеази, які руйнують Ig А1, але не Ig А2.
Вміст Ig D в сироватці складає 0,03 мг/л. Функції цих Ig не зовсім вивчені. Вони складають основну частину мембранних Ig, разом з Ig М.
Концентрація Ig Е в нормальній сироватці дуже низька (0,00005 мг/мл), але їх функції дуже важливі. Вони проявляють свої функції при паразитарних інфекціях та у випадку алергічних реакцій.
При контакті з алергеном синтезується велика кількість Ig Е, які в свою чергу активують тучні клітини та базофіли, що секретують комплекс медіаторів (гістамін та серотонін), які викликають алергічні реакції. Ig Е лежать в основі таких захворювань, як бронхіальна астма, сінна лихоманка, атопічний дерматит, анафілактичний шок. Тому Ig Е – головні медіатори алергії.
Основні властивості антитіл:
1. Специфічність – здатність реагувати лише з одним із безлічі антигенів.
2. Валентність – здатність до одночасної взаємодії з певною кількістю антигенних детермінант.
3. Афінність – ступінь спорідненості до специфічної антигенної детермінанти.
4. Авідність – міцність зв’язку зі специфічною антигенною детермінантою.
Таким чином основною функцією антитіл є зв’язування з антигеном та елімінація цього чужорідного матеріалу із організму.
Моноклональні антитіла. Відомо, що антитіла, що утворюються в організмі в відповідь на введення антигену (бактерії, вірусу і т. ін.), є білками, що називаються імуноглобулінами і захищають організм від хвороб. Але будь-яке чужорідне тіло, яке вводиться в організм, це суміш різних антигенів, що будуть збуджувати продукцію різних антитіл. До того ж в сироватці крові імунізованих тварин антитіло завжди є сумішшю, що складається з антитіл, які продукуються різними лімфоїдними клітинами. Та для практичних цілей необхідні антитіла одного типу, тобто моноспецифічні сироватки з одним типом антитіл. Очистка одного типу антитіл від сумішей – справа дуже складна і трудомістка. І ось в 1975 р. Келєром і Мільдштеймом був розроблений спосіб отримання гібридів між лімфоцитами мишей, імунізованих перед цим якимось антигеном і культивуванням пухлинних клітин кісткового мозку (мієломними клітинами).
Ці гібридні клітини отримали назву гібридоми. Вони об’єднали в собі здатність лімфоциту утворювати необхідні антитіла (одного типу) і здатність пухлинних безкінечно довго розмножуватись на штучних середовищах. Культивуючи гібридоми, а потім імунізуючи ними тварин, можна отримати антитіла необхідного типу і в необмежених кількостях. Показано, наприклад, що з 50…100 мишей можна отримати грами моноклональних антитіл. Моноклональні антитіла, отримані вказаним способом, зараз використовуються в різних областях медицини і біології.
Виробництво моноклональних антитіл займає зараз одне з провідних місць в біотехнології. Крім широкого використання в фундаментальних дослідженнях вони застосовуються для отримання препаратів біологічно активних речовин високої чистоти, широко використовуються як діагностичні реагенти, наприклад для визначення груп крові. Моноклональні антитіла виявились перспективними для лікування ряду захворювань, і в особливості для лікування злоякісних пухлин.
Антиген як функціональний термін. Джерела і хімічна природа антигенів. Термін «антиген» стали використовувати наприкінці 19 ст. для позначення агентів, які викликають утворення антитіл. Від скорочення двох слів «антитіло» і «генерувати» і виникло поняття «антиген». Отже, антигени (АГ) – це такі речовини або ті форми речовин, які при потраплянні у внутрішнє середовище організму здатні індукувати імунну відповідь у вигляді вироблення специфічних антитіл або імунних Т-лімфоцитів. Отже, всі чужорідні субстанції, які розпізнаються організмом належать до антигенів. Але антигени, які здатні індукувати імунну відповідь – імуногени.
Приклади антигенів:
1. Білки – імуногенні речовини.
2. Вуглеводи (полісахариди) – потенційні імуногени (цукри є частиною комплексних сполук, які здатні індукувати імунну відповідь).
3. Ліпіди в основному не є імуногенами, але набувають цих властивостей з білком носієм.
4. Нуклеїнові кислоти – слабкі міуногени, набувають імуногенності в комплексі з білками.
Класифікація антигенів:
1. Повні і неповні (гаптени).
2. Розчинні та корпускулярні.
3. Екзогенні та ендогенні.
4. Т-залежні та Т-незалежні.
5. Гетеро-, ізо (ало)- та аутоантигени.
Таблиця 4.1