Загальні відомості
Загальна кількість лімфоцитів в крові є показником вмісту в організмі імунокомпетентних клітин. Загальна кількість лімфоцитів підраховується на базі лейкоцитарної формули крові (див. Лабораторну роботу №2).
При дуже схожій морфології за походженням і функціональною спрямованістю лімфоцити діляться на дві популяції, які відносяться до Т- чи В-залежної системи.
У крові людини на долю Т-клітин припадає близько 75 % лімфоцитів. В-лімфоцити складають 15%. Інші лімфоцити – це нульові клітини, вони не мають маркерів, характерних для Т- і В-клітин.
Дві основні групи Т- і В-лімфоцитів морфологічно мало відрізняються одна від одної. Основою для визначення популяцій лімфоцитів є знаходження на їхній поверхні специфічних кластерів диференціації CD маркерів за допомогою комплементарних їм молекул чи часточок.
Основні функціональні відмінності цих субпопуляцій лімфоїдних клітин полягають в тому, що В-клітини здійснюють гуморальну імунну відповідь, а Т-лімфоцити – клітинну, а також беруть участь в регуляції обох форм імунної відповіді.
Т-лімфоцити – неоднорідна за своїми функціональними властивостями група лімфоїдних клітин. Розрізнять декілька субпопуляцій Т-лімфоцитів: Т-хелпери, цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) і Т-клітини пам’яті.
На поверхні всіх Т-лімфоцитів перебуває низка специфічних молекул: рецептори до еритроцитів барана, Т-клітинні антиген розпізнавальні рецептори (ТАГРР), молекули СD3, які є складовою частиною ТАГРР, рецептори до міогенів, рецептори до цитокінів (ІЛ-1β, ІЛ-2 тощо), антигени HLA класу І. На субпопуляції Т-хелперів додатково експресується молекула СD4, а на цитотоксичних Т-лімфоцитах – СD8. Існують й інші рецептори Т-лімфоцитів. Нижче наведена коротка характеристика основних поверхневих молекул Т-клітин:
1) ТАГРР за структурою подібний до молекули імуноглобуліну, але не тотожний йому. він побудований з константної ділянки, за рахунок якої утримується на мембрані клітини, і двох варіабельних ділянок, що безпосередньо беруть участь у розпізнанні імуногенного пептиду. Рецептор антигенного розпізнавання Т-лімфоцитів працює у комплексі з так званою СD3-структурою, що складається з 6 білків, які передають активаційний сигнал всередину клітини при збудженні рецептору антигенного розпізнавання. Отже, сигнал, переданий СD-3 комплексом, запускає активаційні імунобіохімічні процеси в цитоплазмі Т-клітини. відсутність таких молекул призводить до розвитку тяжкого імунодефіцитного захворювання.
2) СD2 – це поверхневий антиген, який виявлений на всіх зрілих периферійних Т-лімфоцитах. за природою СD2 є адгезивною молекулою. СD2-рецептор приймає участь у процесі активації Т-лімфоцитів, що важливо для проліферації клітин у тимусі.
3) СD3 – це комплекс молекул, який є сигнальною частиною антигенрозпізнавального рецептору Т-лімфоцита.
4) Рецептор до мітогенів – при взаємодії деяких лектинів рослинного походження (фітогемаглютиніну ФГА і конканаваліну А Кон-А) виникає активація, трансформація та проліферація Т-лімфоцитів у культурі in vitro. Ця властивість використовується для оцінки проліферативної активності Т-лімфоцитів (реакції бласттрансформації РБТЛ).
5) СD4 – це молекула, яка перебуває на субпопуляції Т-хелперів, і є необхідною для взаємодії антиген розпізнавального рецептору з молекулою HLA ІІ класу.
6) СD8 – поверхневий маркер, який експресується на мембранах цитотоксичних Т-лімфоцитів.
Цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) – одна з основних клітин клітинно-опосередкованого імунітету, яка, разом з іншими клітинами, здатна здійснювати лізис мішеней. Маркерами Т-кілерів служать поверхневі антигени СD 56 і СD 16. Крім того, вони мають антиген СD 2, властивий більшості клітин лімфоїдного ряду. Т-кілери приймають участь в реалізації трансплантаційного імунітету, в розвитку аутоіммунних захворювань і в протипухлинному захисту.
Т-хелпери – складають 55 – 60% від числа циркулюючих Т-лімфоцитів. Вони несуть на своїй поверхні антиген СD4, а також рецептор до Fс-фрагмента IgМ. Т-хелпери включають В-лімфоцити в проліферацію і диференціювання, що забезпечує накопичення відповідного клону плазматичних клітин, що інтенсивно синтезують антитіла проти імунізуючого антигену. Функціональна активність Т-хелперів опосередкована гуморальними хелперними чинниками, які синтезуються цими лімфоцитами у відповідь на антигенний стимул.
Т-хелпери, стимулюючі інші Т-лімфоцити до вироблення хелперних сигналів, називають Т-підсилювачами – ампліфайєрами (від англ. to amplifier – посилювати). Недостатність хелперной функції Т-лімфоцитів призводить до відсутності відповіді організму на антигенну стимуляцію і, зрештою, сприяє персистенції в організмі людини великої кількості мікроорганізмів, розвитку злоякісних новоутворень і може бути причиною летального наслідку (смерті).
Т-клітини пам’яті після стимуляції антигеном здатні зберігати інформацію про нього до 10 – 15 років і передавати її іншим клітинам. Завдяки наявності в організмі Т-клітин пам’яті забезпечується прискорена імунна відповідь за вторинним типом при повторному попаданні даного антигену в організм.
В-лімфоцити – друга основна популяція лімфоцитів. В-клітини, перетворюючись при активації в плазматичні клітини, забезпечують продукцію антитіл. Рецепторами В-лімфоцитів для розпізнавання антигенів є молекули імуноглобулінів. На поверхні однієї В-клітини знаходиться 200 – 500 тис. імуноглобулінових молекул однакової специфічності. Ті, що відокремилися від В-лімфоцита іммуноглобулінові рецептори циркулюють в організмі як вільні антитіла.
Контакт з антигеном може служити стимулом для проліферації і диференціювання В-лімфоцита з подальшим формуванням клону однорідних клітин-нащадків, кінцевою стадією розвитку яких є плазматичні клітини, оптимально адаптовані до продукції великих кількостей антитіл.
Залежно від здатності клітин синтезувати антитіла в присутності або у відсутності стимулюючого сигналу Т-лімфоцитів серед популяції В-лімфоцитів виділяють два субкласи (В1- і В2-лімфоцити).
Дослідження лімфоцитів. Дослідження лімфоцитів включає етап виділення фракції мононуклеарів з периферійної крові. З цією метою використовують метод градієнтного центрифугування. Кров поміщають у розчин гепарину, розводять втричі забуференим ізотонічним розчином натрію хлориду та обережно нашаровують на розчин фіколу (для підвищення густини у розчин фіколу додають рентгенконтрастний препарат для внутрішньовенного введення – наприклад, верографін). В результаті між плазмою та розчином фіколу утворюється градієнт густини. Після центрифугування еритроцити та гранулоцити проходять крізь фікол та осідають на дно, а мононуклеари (моноцити та лімфоцити) залишаються у вигляді кільця в інтерфазі. Клітини збирають піпеткою, відмивають, переносять у культуральне середовище і досліджують зо допомогою різних методів.
Розділення клітин в градієнті густини. Принцип розділення клітин крові в градієнті густини заснований на відмінностях у величині їх плавучої густини. При центрифугуванні в градієнтному розчині клітини крові переміщуються в пробірці до тих пір, поки не досягнуть області градієнта, де їх плавуча густина дорівнює густині середовища.
Густина градієнта для фракціонування формених елементів крові людини і тварин різна. Для розділення лімфоїдних клітин людини використовують градієнт густини, рівний 1,077 г/см, а лімфоцитів миші – 1,119 г/см. При цьому плавуча густина мононуклеарів і лімфоцитів менша, ніж така величина використовуваного градієнта, тому ці клітини розташовуються над градієнтом. Гранулоцити і еритроцити, що мають велику плавучу густину, в процесі седиментації проходять через градієнтний розчин і опускаються на дно пробірки.
В якості градієнта густини для розділення клітин крові можна використати суміш фіколу з рентгеноконтрастними речовинами з високою щільністю (урографін, верографін, уротраст або ізопак).
Фікол – це фірмова назва синтетичного високомолекулярного сополімера сахарози і епіхлоргідрину. У імунологічних дослідженнях використовують 6,1% або 9% розчини фіколу з молекулярною масою 400 кДа (Фікол 400). Для отримання градієнтних розчинів з необхідною густиною змішують розчин фікола з 76% розчином урографіна (верографіна) в певному співвідношенні. За допомогою ареометра обережно доводять густину урографіна розчином фікола 400 до необхідної величини. Отриману суміш фікола з урографіном стерилізують в автоклаві при 0,11 МПа упродовж 30 хв або за допомогою фільтрації на бактеріальних фільтрах.
Слід зазначити, що при застосуванні методу седиментації в градієнті густини для виділення лімфоцитів із загальної суспензії формених елементів крові необхідно використати кров, звільнену від фібрину.
Отримання дефібринованої крові. Виділення лімфоцитів з крові донорів проводять за допомогою метода седиментації в градієнті щільності фіколл-урографіну. У центрифужну пробірку на 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл) нашаровують 3 мл розведеної крові (попередньо цільну гепаринізовану кров розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1:3 кров:фізрозчин). Центрифугування здійснюють при 1500 об/хв. У результаті центрифугування кров розділяється на 4 окремі фракції: перша фракція на дні пробірки містить еритроцити і уламки клітин крові. Друга фракція – це розчин фікол-урографіну. Третя фракція, розташована над градієнтом, являє собою суспензію лімфоїдних клітин. Четверта фракція утворена плазмою з тромбоцитами (Рис. 3.1). Шар лімфоцитів (лімфатичне кільце) обережно збирають по всій площі перерізу пробірки, переносять в чисту, суху центрифужну пробірку і розбавляють розчином Хенкса (розчином 199) в співвідношенні 1:4. Вміст пробірки центрифугують 5 хв. Потім надосадову рідину видаляють, а отриманий осад ресуспендирують в розчині Хенкса.
а б
Рис. 3.1. Схема розділення форменних елементів крові на градієнті щільності фікол-верографіну. Позначення: а – до центрифугування кровіі, б – після центрифугування крові, 1 – градієнт щільності фікол-верографіну, 2 – кров,
3 – еритроцити, 4 – лімфоцити, 5 – плазма крові
Методи лабораторних досліджень лімфоцитів. Всі методи дослідження лімфоцитів можна поділити на дві групи:
Вивчення поверхневих маркерів;
Функціональні тести.
У 1983 році Перша міжнародна нарада з антигенів диференціювання лімфоцитів ввела в практику клінічної імунології термін «Clusters of differetiation» (кластери диференціації, скорочено CD), а у 1989 році четверта нарада прийняла першу робочу номенклатуру CD.
На сьогодні для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів та низки інших клітин використовують три групи методів:
а) методи імунофлюоресценсії;
б) імуноферментні методи;
в) розеткоутворення.
Методи розеткоутворення. Використовуються в імунології з початку 70-х років. Ці методи дозволили імунологам розділяти і визначати Т- і В-лімфоцити периферійної крові, коли були відсутні необхідні антитіла для виявлення цих клітин. Методи розеткоутворення є найдешевшими серед методів кількісного визначення субпопуляції лімфоцитів. Методи розеткоутворення засновані на феномені прилипання до поверхні клітин корпускулярних часток, що призводить до фіксації останніх на поверхні імунокомпетентних клітин (ІКК) і утворенню добре видимих у світловий мікроскоп комплексів лімфоцит-еритроцити, що іменуються розетками (Рис 3.2). Ці реакції дістали назву реакцій розеткоутворення.
Найбільш простими є методи розуткоутворення з еритроцитами тварин. Кількість Т-лімфоцитів можна визначити за допомогою тесту розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУЛ), оскільки доведено, що CD2 рецептори Т-лімфоцитів ідентичні Е-рецепторам і мають спорідненість до глікопротеїнів мембрани еритроцитів барана. В-лімфоцити мають рецептор до компоненту С3 комплементу. Тому використовують метод комплементарного розеткоутворення з еритроцитами бика (чи часточками зимозану), нагружених С3 компонентом комплементу. Також для визначення В-лімфоцитів використовують еритроцити барана «нагружені» антитілами (IgM) в середовищі комплементу.
ЕАС-комплекс – суміш еритроцитів барана, анти-сироватки, що містить антитіла до еритроцитів барана (отримали шляхом імунізації кролика еритроцитами барана), свіжої сироватки мишей, що містить комплемент.
Для постановки реакції суспензію лімфоцитів інкубують з суспензією еритроцитів тварин. Після цього підраховують кількість клітин, які утворили розетки. Розеткою називають клітину, до якої прикріплені не менше, ніж три еритроцити. При підрахунку знаходять 100 або 200 лімфоцитів і вираховують відсоток розеток серед них. Знаючи загальну кількість лімфоцитів, можна кількісно підрахувати чисельність популяції.
Рис.3.2. Схема комплексу лімфоцит (1) – еритроцити барана (2)
Пізніше було встановлено, що кількість недоліків у реакціях розеткоутворення досить велика. Отримані результати залежать від умов постановки експерименту, від якості реактивів, визначаються не лише експресією маркерних молекул, але і станом цитоскелету клітин та ін.
Нині, у зв'язку з появою технології отримання моноклональних антитіл до маркерних молекул імуноцитів, метод розеткоутворення втратив своє значення і практично не застосовується в клінічній імунології для визначення кількісного складу Т- і В-субпопуляцій в периферичній крові.
У експериментальній імунології його використовують для отримання інформації про зміну функціональної активності лімфоїдних клітин під впливом зовнішніх фізичних (УФ-радіація) або хімічних (лікарські препарати, цитокіни і їх індуктори) факторів.