- •Депарпамент образования и науки
- •Оглавление
- •Глава 1. Особенности некоторых методов микроскопии
- •Устройство и принцип работы темнопольного конденсора ои-13
- •1.1.1. Условия работы с темнопольным конденсором
- •1.1.2. Порядок работы с темнопольным конденсором:
- •Принцип и порядок работы с фазово-контрастным устройством кф-4
- •1.2.1.Устройство фазово-контрастной приставки кф-4
- •1.2.2. Порядок работы с фазово-контрастным устройством
- •Глава 2. Методы окраски фиксированных препаратов
- •2.1. Подготовка красителей и реактивов для окраски по методу Грама и техника окрашивания
- •2.1.1. Особенности подготовки красителей
- •2.1.2. Техника окраски по методу Грама
- •2.1.3. Дифференциация бактерий по Граму без окрашивания
- •2.2. Выявление кислотоустойчивости и спиртоустойчивости бактерий
- •2.2.1. Окраска по методу Циля-Нильсена
- •2.2.2. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий
- •2.3. Методы окраски спор у бактерий
- •2.3.1. Метод Циля — Нильсена в модификации Мюллера
- •3.3.2. Окраска спор по методу Пешкова
- •2.3.3. Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева
- •2.3.4. Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона
- •2.3.5. Окраска спор по Битеру
- •2.3.6. Реактивы и красители для окрашивания спор бактерий:
- •2.4. Методы окраски капсул
- •2.5. Методы окраски жгутиков бактерий
- •2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера
- •2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову
- •2.5.3. Окраска жгутиков по методу Грея
- •2.6. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •2.7. Окраска генома бактерий
- •2.7.1. Окраска генома бактерий методом Романовского-Гимза
- •2.7.2. Выявление генома по реакции Фельгена
- •Глава 3. Определение качественного состава микроорганизмов по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам
- •3.1. Морфологические признаки
- •3.2. Культуральные признаки
- •Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов
- •3.3.1. Тест на наличие каталазы
- •3.3.2. Тест на наличие оксидазы
- •3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)
- •3.3.4. Тест на наличие уреазы
- •3.3.5. Тест на наличие протеолитической активности (протеиназы)
- •3.3.6. Тест на наличие диастазы (амилазы)
- •3.3.7. Тест на наличие липазы
- •3.3.8. Тест на использование углеводов и органических кислот
- •Тест на редуцирующую способность микроорганизмов
- •Тест на декарбоксилазы и дегидролазы
- •3.3.11. Тест на образование индола и сероводорода
- •3.3.12. Тест на использование фумарата в анаэробных условиях
- •Список использованной литературы
- •Методы исследований при идентификации микроорганизмов Методическое пособие
2.7. Окраска генома бактерий
О наличии генома при цитохимических исследованиях судят по качественной реакции на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая входит в его состав.
2.7.1. Окраска генома бактерий методом Романовского-Гимза
Этим методом в клетках прокариот одновременно выявляют геном клетки и волютин.
Сначала препарат фиксируют 5 мин метиловым спиртом или, фиксатором Карнуа или, смесью Никифорова. В случае использования фиксатора Карнуа для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского — Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной (рН 7,2) водой, высушивают и микроскопируют. Геном окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма — в слабо-розовый.
Краситель Карнуа содержит абсолютный спирт, хлороформ, ледяную уксусную кислоту в соотношении 6: 3: 1.
Красатель Романовского — Гимза. Промышленность выпускает препарат, представляющий собой смесь азура (органического красителя, полученного из метиленового синего), эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды, имеющей нейтральную или слабощелочную реакцию (рН 7,2), прибавляют 10 капель красителя.
2.7.2. Выявление генома по реакции Фельгена
Реакцию применяют для окраски ДНК. При слабом кислотном гидролизе нуклеопротеидов происходит отщепление пуриновых и пиримидиновых оснований, ведущее к высвобождению дезоксирибозы, входящей в ДНК.
При гидролизе дезоксирибоза переходит в β-гидроксилевулиновый альдегид, который взаимодействует с сернистой частью бесцветной фуксинсернистой кислоты, выделяя фуксин красного цвета. В результате геном окрашивается.
Препараты бактерий обрабатывают фиксатором Карнуа 5 мин, промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 мин в растворе 1 н. НС1, подогретой до 60 0С, погружают на 1—2 мин в холодный раствор 1 н. НС1 и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3 — 4 ч. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 мин в каждой, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Геном окрашивается в фиолетовый цвет.
Приготовление реактива Шиффа. К 1 г парафуксина (С19Н18N3Cl) прибавляют 200 мл кипящей дистиллированной воды и кипятят в течение 5 мин. Раствор горячим фильтруют через складчатый фильтр в темную склянку. Охлаждают до 50 0С и добавляют 20 мл 1н раствора НСl. Охлаждают до 25 0С и добавляют 1 г бисульфита натрия (NaHSO3) или метабисульфита (Na2S2O5). Раствор приобретает темно-вишневый цвет, который в темной склянке с притертой пробкой, смазанной вазелином, ставят в холодильник при температуре 2-5 0С. В течение суток раствор обесцвечивается вследствие перехода парафуксина в фуксинсернистую кислоту. Допустим слабо-желтый оттенок раствора. В этих условиях раствор хранится 2-3-месяца.
Ели раствор имеет бурую окраску, к нему прибавляют 2 г активированного угля, взбалтывают 1 мин и фильтруют. Если раствор имеет розовую окраску, то прибавляют несколько кристаллов бисульфита натрия.