9. Тест на редуцирующую способность микроорганизмов

Редуктаза - анаэробная дегидрогеназа, катализирующая передачу водорода от окисляемого субстрата любому ненасыщенному соединению, кроме кислорода воздуха. Тесты по определению редуцирующей активности основаны на обесцвечивании красителей метиленового синего или резазурина.

Свежее молоко доводят на огне до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают его от сливок, вторично кипятят, снова оставляют на сутки и снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10%-ным раствором углекислого натрия до рН 7,2. К 100 мл молока добавляют 2 мл 1%-го водного раствора метиленового синего или 10 мл 0,0005%-го водного раствора резазурина, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. После остывания среда имеет насыщенно голубой цвет или сине-стальной при использовании резазурина.

Подготовленные пробирки засевают исследуемыми молодыми культурами микроорганизмов При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, при слабоположительной – приобретает зеленоватое окрашивание; на редукцию резузарина – среда приобретает сиреневые, розовые оттенки или становится белой.

9. Тест на декарбоксилазы и дегидролазы

Аминокислоты могут подвергаться дезаминированию, декарбоксилированию или разрушаться через дегидролазный путь расщепления. При декарбоксилировании образуются первичные амины и СО₂. Декарбоксилазы образуются, как правило, в кислой среде. Эти реакции известны, например, для лизина, орнитина. В процессе декарбоксилирования, помимо СО₂, из L-лизина образуется диамин кадаверин, а из L-орнитина – диамин путресцеин. Иначе происходит расщепление L-аргинина, на котрый воздействует комплекс из декарбоксилазы и дегидролазы. Через промежуточные продукты обмена (L-орнитин, мочевина) расщепление аргинина завершается образованием путресцина и СО₂, а при наличии уреазы – образуется аммиак.

Инокулируют основной бульон Меллера состава (г/л): пептический гидролизат животной ткани — 5; экстракт из говяжьего мяса — 5; глюкоза — 0,5; пиридоксаль — 0,005; бромкрезоловый красный (1,6%-ный раствор) — 0,625 мл; крезоловый красный (0,2% -ный раствор) — 2,5 мл; вода дистиллированная. Компоненты смешивают, доводят рН смеси до 6,0 или 6,5. Смесь разливают в большие пробирки и стерилизуют автоклавированнем при 0,5 атм. К этой среде добавляют 1%-ный моногидрохлорид L-аргинина (или 2%-ный DL-формы) или 1%-ный раствор дигидрохлорида L-орнитина или 2%-ный раствор DL-формы (или лизина), а также контрольный бульон без аминокислот. После инокуляции бульон заливают 10 мл стерильного минерального (вазелинового) масла. Пробу проверяют ежедневно в течение 4 дней. Положительная реакция — фиолетовая или красно-фиолетовая окраска. При слабой реакции образуется голубовато-серая окраска.

Можно использовать среду следующего состава (г/л): пептон – 5,0; глюкоза – 1,0; бромтимоловый (бромкрезоловый) синий – 0,03; L-аминокислота (или лизин, или орнитин, или аргинин) – 10,0 или DL-аминокислота – 20,0. Все компоненты нагревают, при необходимости фильтруют, доводят рН до 6,0-6,1, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Готовая среда имеет желтовато-зеленый цвет.

Изменение цвета среды с аминокислотой и бромтимоловым синим с желтовато-зеленого на синий вследствие защелачивания среды образовавшимися аминами (диаминами) или аммиаком свидетельствует соответственно о наличии лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы или аргининдекаобоксилазы. Изменение цвета среды на желтый указывает на образование кислых продуктов в результате роста микробной культуры и отсутствие декарбоксилазы. Цвет среды в контрольной пробирке с растущей культурой будет также изменяться на желтый. При отсутствии роста цвет среды не изменяется.

Положительный результат — Enterobacter cloacae, Enterabacter aerogenes; отрицательный — Proteus vulgaris.