2.2. Выявление кислотоустойчивости и спиртоустойчивости бактерий

В связи с высоким содержанием липидов эта группа бактерий плохо прокрашивается обычными растворами анилиновых красителей, поэтому для их окраски используют либо концентрированные красители при условии прогревания мазка, либо флюорохромы для изучения препарата с помощью люминесцентной микроскопии.

Кислотоустойчивость — свойство, наиболее характерное для микобактерий и некоторых актиномицетов. Оно связано с особенностями химического состава клеточных стенок, главным образом — с наличием в них миколовых кислот. Кислотоустойчивость проявляется в том, что клетки с трудом воспринимают красители, а при окрашивании — прочно их удерживают.

2.2.1. Окраска по методу Циля-Нильсена

До фиксации мазка бактерий на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, обильно смачивают ее карболовым фуксином Циля и нагревают препарат над пламенем 5 мин. Нельзя допускать высыхания препарата: в случае необходимости следует добавить 1 — 2 капли воды. Нельзя также доводить краситель до кипения: как только появятся пары, препарат отводят в сторону. По окончании окрашивания и охлаждения препарата бумагу удаляют, а мазок промывают слабой струей водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке. Затем препарат промокают фильтровальной бумагой и погружают на 3 — 5 сек в 5%-ный раствор H₂SO₄ или 3%-ный раствор HC1. Еще раз промывают препарат водой, промокают и окрашивают в течение 3 — 5 мин метиленовым синим Леффлера. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые — в синий.

2.2.2. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий

1. Карболовый фуксин Циля: см. пункт 2.1.3а

2. Метиленовый синий Леффлера:

а) насыщенный спиртовой раствор метиленового синего: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-ного этилового спирта. Раствор оставляют на 2-3 дня, в течение которых несколько раз взбалтывают, затем фильтруют. Хранят в емкости из темного стекла длительное время;

б) 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-ного раствора КОН.

3. Серная кислота — 5%-ный раствор или соляная кислота— 3%-ный раствор.

2.3. Методы окраски спор у бактерий

Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды.

При наблюдении за живыми спорообразующими бактериями их споры можно различить по более сильному преломлению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней свободной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными (негативная окраска).

В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочкой на первом этапе окраски спор применяют химические вещества, изменяющие структуру их оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Для того чтобы на препарате оставались прокрашенными только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, забирая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Этого достигнуть нетрудно, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем поглощенный цитоплазмой клетки.

Таким образом, все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.