- •Депарпамент образования и науки
- •Оглавление
- •Глава 1. Особенности некоторых методов микроскопии
- •Устройство и принцип работы темнопольного конденсора ои-13
- •1.1.1. Условия работы с темнопольным конденсором
- •1.1.2. Порядок работы с темнопольным конденсором:
- •Принцип и порядок работы с фазово-контрастным устройством кф-4
- •1.2.1.Устройство фазово-контрастной приставки кф-4
- •1.2.2. Порядок работы с фазово-контрастным устройством
- •Глава 2. Методы окраски фиксированных препаратов
- •2.1. Подготовка красителей и реактивов для окраски по методу Грама и техника окрашивания
- •2.1.1. Особенности подготовки красителей
- •2.1.2. Техника окраски по методу Грама
- •2.1.3. Дифференциация бактерий по Граму без окрашивания
- •2.2. Выявление кислотоустойчивости и спиртоустойчивости бактерий
- •2.2.1. Окраска по методу Циля-Нильсена
- •2.2.2. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий
- •2.3. Методы окраски спор у бактерий
- •2.3.1. Метод Циля — Нильсена в модификации Мюллера
- •3.3.2. Окраска спор по методу Пешкова
- •2.3.3. Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева
- •2.3.4. Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона
- •2.3.5. Окраска спор по Битеру
- •2.3.6. Реактивы и красители для окрашивания спор бактерий:
- •2.4. Методы окраски капсул
- •2.5. Методы окраски жгутиков бактерий
- •2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера
- •2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову
- •2.5.3. Окраска жгутиков по методу Грея
- •2.6. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •2.7. Окраска генома бактерий
- •2.7.1. Окраска генома бактерий методом Романовского-Гимза
- •2.7.2. Выявление генома по реакции Фельгена
- •Глава 3. Определение качественного состава микроорганизмов по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам
- •3.1. Морфологические признаки
- •3.2. Культуральные признаки
- •Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов
- •3.3.1. Тест на наличие каталазы
- •3.3.2. Тест на наличие оксидазы
- •3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)
- •3.3.4. Тест на наличие уреазы
- •3.3.5. Тест на наличие протеолитической активности (протеиназы)
- •3.3.6. Тест на наличие диастазы (амилазы)
- •3.3.7. Тест на наличие липазы
- •3.3.8. Тест на использование углеводов и органических кислот
- •Тест на редуцирующую способность микроорганизмов
- •Тест на декарбоксилазы и дегидролазы
- •3.3.11. Тест на образование индола и сероводорода
- •3.3.12. Тест на использование фумарата в анаэробных условиях
- •Список использованной литературы
- •Методы исследований при идентификации микроорганизмов Методическое пособие
2.5.3. Окраска жгутиков по методу Грея
Растворы, составляющие протраву смешивают за сутки перед употреблением. Раствор 1: 5 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов (К2SO4 x 12Н2О), 2 мл 20%-го водного раствора танина, 2 мл насыщенного водного раствора двухлористой ртути; раствор 2: 0,4 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина.
Протраву наливают на препарат на 8-10 мин, затем промывают его дистиллированной водой и окрашивают 5 мин карболовым фуксином Циля, снова промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
2.6. Окраска включений клеток микроорганизмов
Включения — это вещества, возникающие в результате метаболизма клетки.
Окраска волютина (метахроматических гранул) методом Омелянского. Волютин — полифосфат, запасное фосфор и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. Характерные свойства волютина — сродство к основным красителям и метахромазия, т. е. способность приобретать иной цвет, чем цвет окрашивающего вещества.
Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На обезжиренное стекло наносят тонкий мазок бактерий, сушат его на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином Циля. Через 0,5— 1 мин промывают препарат водой, обесцвечивают 20 — 30 с 1%-ным раствором Н2SO4, промывают, дополнительно 20— 30 с окрашивают метиленовым синим (1:40), промывают, промокают, наносят масло и смотрят с иммерсионной системой. Гранулы волютина окрашены в красный цвет на фоне синей цитоплазмы.
Можно окрашивать фиксированные препараты 10 — 30 с метиленовым синим Леффлера или 1%-ным раствором толуидинового синего, затем промыть препарат водой, промокнуть фильтровальной бумагой и рассмотреть под микроскопом. В первом случае (при окраске метиленовым синим) гранулы имеют цвет от синего до фиолетового, во втором — они красные на фоне голубой цитоплазмы.
Окраска гликогена. Гликоген — углевод, животный крахмал. Встречается у эукариот и прокариот. Часто гликоген накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде. Включения гликогена хорошо исследовать в 1 — 2-суточных культурах Saccharamyces cerevisiae и Bacillus mycoides.
На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов и к ней добавляют такую же каплю раствора I в KI (7 г I2 и 20 г KI на 100—300 мл дистиллированной воды). Сверху помещают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Препарат просматривают с масляной иммерсией.
На препарате Saccharomyces cerevisiae много почкующихся клеток. В образующихся (растущих) почках гликогена практически нет, поскольку углеводы расходуются в процессе активного метаболизма и гликоген не запасается. В материнских клетках окраска гликогена интенсивна — в зависимости от степени его накопления она варьирует от ярко-желтых оттенков до коричнево-желтых.
Окраска гранулезы. Гранулеза — углевод, крахмалоподобное вещество. Встречается только у прокариот и только в клетках маслянокислых бактерий Clostrtdium butyrtcum перед спорообразованием. Обычно гранулезы накапливается значительное количество.
В небольшую каплю суспензии маслянокислых бактерий добавляют такую же каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и просматривают с масляной иммерсией.
Окраска жира. Жир содержится в клетках практически всех видов микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры. Объектами для исследования могут служить старые культуры дрожжей, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium.
На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-ного раствора формалина. Петлей в нее вносят культуру микроорганизма. Формалин убивает клетки и разрыхляет их оболочки. Через 5 мин в эту же каплю добавляют небольшую каплю метиленового синего, а спустя 10 мин — каплю судана III (растворимого в жире красителя, индикатора жироподобных веществ). Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют препарат с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашивается в синий цвет, включения жира — в розово-оранжевый.
Многие гранулы, окрашивающиеся суданом III (0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-ного спирта или концентрированной молочной кислоты) или суданом черным В (0,3%-ным раствором в 70%-ном этиловом спирте (для растворения судана черного спирт берется горячий и раствор выдерживают несколько часов на водяной бане в течение 1-2 часов при температуре 60 0С)), состоят из поли-β-оксимасляной кислоты. Для выявления поли-β-оксимасляной кислоты готовят препарат клеток 24-часовой культуры. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают суданом черным 5— 15 мин (краситель может при этом высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него стекло. Время обесцвечивания не должно превышать 1 мин. Дополнительное окрашивание препарата проводят 0,5%-ным водным раствором сафранина в течение 5 — 10 с. Включения поли-β-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.