Глава 1. Особенности некоторых методов микроскопии

Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Форма, размеры, взаиморасположения клеток, поверхностные структуры, внутренняя организация микроорганизмов являются их важной характеристикой, лежащей в основе таксономии. Поэтому одним из основных методов исследований в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляет световая микроскопия со всеми ее разновидностями. В микробиологической практике в зависимости от целей исследований применяют светопольную микроскопию, фазово-контрастную, темнопольную, люминесцентную, электронную.

Поподробнее остановимся на особенностях темнопольной и фазово-контрастной микроскопий.

1. Устройство и принцип работы темнопольного конденсора ои-13

Движение бактерий и спирохет можно наблюдать с помощью темнопольной микроскопии, которая отличается от обычной светопольной способом освещения препарата. В основе метода лежит эффект Тиндаля – рассеивающийся пучок света при наблюдении сбоку имеет вид голубоватого конуса на темном фоне. В этом случае применяют боковое освещение «косыми» лучами. Лучи не попадают в объектив и поле зрения выглядит темным. Если препарат содержит клетки микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности клеток и настолько уклоняются от своего первоначального направления, что попадают в объектив. В итоге наблюдатель видит на черном фоне интенсивно светящиеся объекты. Этот эффект позволяет увеличить разрешающую способность микроскопа.

Метод темного поля применяется для получения изображений прозрачных, не поглощающих свет объектов и поэтому невидимых при наблюдении в светлом поле.

Темнопольный конденсор состоит из сферического зеркала и линзы-кардиоиды, склеенных между собой и вставленных в оправу, ввернутую в цилиндр. Цилиндр укреплен на кольце внутри корпуса конденсора. Конденсор снабжен пружинящим упором и двумя центрировочными винтами. Дополнительная деталь – вставная диафрагма для объектива (иммерсионного).

1.1.1. Условия работы с темнопольным конденсором

1. Апертура темнопольного конденсора должна быть на 0,2-0,4 единицы больше апертуры объектива; (апертура – это оптический «охват» линзы, мера количества света попадающего в линзу).

2. Так как темнопольный конденсор пропускает только часть светового потока, то освещенность должна быть максимальной и правильной, независимо от используемого объектива.

3. Толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм.

4. Особое внимание уделяется чистоте предметных и покровных стекол, так любые загрязнения (пыль, царапины, пузырьки воздуха) преломляют свет и изображение менее контрастное.

1.1.2. Порядок работы с темнопольным конденсором:

1. провести настройку освещения микроскопа:

• установить матовое стекло в откидную рамку конденсора;

• установить объектив наименьшего увеличения (8Х, 10Х);

• поднять кронштейн с конденсором до упора вверх и полностью раскрыть апертурную диафрагму конденсора;

• проверить правильность расположения нити лампы, вынув патрон с лампой, а затем вставив его в шарнир до упора таким образом, чтобы нить лампы располагалась горизонтально;

• включить микроскоп в сеть;

• сфокусировать микроскоп на резкое изображение препарата; перемещая патрон с лампой за рукоятку вдоль оси и разворачивая его вместе с шарниром в горизонтальной плоскости, добиться наиболее яркого и равномерного освещения поля зрения микроскопа;

2. используя светопольный конденсор провести

центрировку предметного столика:

• установить центрировочную пластину на предметный столик; в столике предварительно установить держатель объекта так, чтобы его риска точно совпала с риской шкалы и ярлык центрировочной пластины располагался около держателя;

• установить объектив 10Х и в окуляр (левый в бинокулярной насадке) 7Х вставить разделительную шкалу;

• с помощью рукояток предметного столика установить координаты шкал, указанные на ярлыке;

• наблюдая в окуляры микроскопа, с помощью регулировочных винтов добиться совпадения перекрестий центрировочной шкалы и шкалы окуляра;

3. светопольный конденсор заменить на темнопольный;

4. отцентрировать оптическую систему конденсора относительно объектива так, чтобы при отсутствии препарата в выходном зрачке объектива не было света;

5. на верхнюю линзу конденсора нанести каплю иммерсионного масла, независимо от увеличения используемого объектива;

6. установить препарат и поднять конденсор так, чтобы иммерсионная жидкость соприкоснулась с предметным стеклом и распространилась по нему;

7. сфокусировать микроскоп на объект. При правильной подготовке и работе эффект темного поля обеспечен.